基于PCR-DGGE技术的厌氧颗粒污泥中微生物多样性研究

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近年来以厌氧反应器处理为核心技术的厌氧-好氧生物处理工艺,以其较高的处理效率和后续产生生物能源沼气,作为一种能够实现污水资源化、极优秀的废水生物处理工艺引起了国内外研究人员的普遍关注,成为未来废水处理技术的一个重要发展趋势。在UASB、EGSB、IC为代表的厌氧反应器中,厌氧消化能否顺利进行很大程度上取决于颗粒污泥的活性及其微生物多样性特征。颗粒污泥通过不同种属微生物的自固定过程而形成,这些微生物协同承担着废水中有机物的代谢消化。厌氧反应器运行过程中废水底物的不同将导致厌氧颗粒污泥微生物的组成发生显著的变化,进而对反应器运行效果产生直接的影响。为此,本论文以四个相同体积UASB反应器的稳定运行为主体,采用PCR-DGGE技术考察了不同运行阶段、不同废水底物条件下,反应器内颗粒污泥微生物的动态变化特征。主要研究内容与结论如下:(1)四个反应器的启动和稳定运行:编号为1、2、3、4的四个反应器在启动初期进液葡萄糖模拟废水,以探索其最佳操作条件;启动完成后1、2号反应器以葡萄糖模拟废水继续进液,3、4号反应器以一定进液比例处理不同实际废水(3号反应器处理造纸废水,4号反应器处理印染废水),并监测反应器运行状态参数及颗粒污泥物化性质的变化。实验结果表明:在启动驯化阶段,进液COD浓度2000mg·L-1,水力停留时间22.8h,进水流量3.16L·d-1为四个反应器的稳定运行条件;启动完成时反应器容积负荷达到2.5kgCOD·m-3·d-1,COD去除率均稳定在95%以上;进实际废水后,造纸废水对反应器运行效果和反应器内颗粒污泥的影响不大,3号反应器的COD去除率为90~95%。污泥的比产甲烷活性0.37gCOD·gVSS-1·d-1;印染废水水质毒性较大,4号反应器的COD去除率最后在85~90%,且最终比产甲烷活性小于0.30gCOD·gVSS-1·d-1;(2)运用PCR-DGGE技术研究对厌氧颗粒污泥微生物多样性的实验条件进行了优化。经过对比实验研究发现,DNA模板的浓度、退火温度和延伸时间对PCR的结果有显著的影响。在巢式PCR扩增中,第二轮PCR的模板应为第一轮产物稀释50倍后的样品;古菌扩增中,退火温度为58°C,延伸时间为40s时效果最好;不同聚合酶对PCR的结果影响不大;DGGE电泳中,细菌与古菌对变性剂浓度梯度的要求不同,古菌为30~45%,细菌为40~60%,电压为80V,时间10h时,两者均能得到较好分离效果的DGGE图谱;对于DGGE胶的染色,强碱银染法较EB染色和弱碱银染法更为有效;(3)在优化条件下,使用PCR-DGGE技术对比了3种废水底物下不同运行阶段的厌氧颗粒污泥的微生物多样性的变化。实验结果表明:反应器内颗粒污泥的细菌菌群分为两大类,一类为调整水质变化和应对环境变化的调节性细菌菌群,另一类在反应器稳定运行阶段才逐渐突出并占据优势,即代谢功能细菌,由其承担有机物的分解和产氢产乙酸过程。古菌菌群结构在运行过程中变化复杂,但总体上优势古菌并未发生明显变化。只有当进液水质改变时一些针对这些变化的古菌物种滋生,但是经过一段时间适应后,反应器内古菌菌群会逐渐恢复到原来水平,即产甲烷代谢菌为主的优势菌群结构状态,从而保证厌氧消化过程中最后一步产甲烷的顺利完成。
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