一、研究目的骨性关节炎是好发于老年人的常见的复杂的关节疾病,为关节软骨的退行性改变,有许多病理途径及因素影响其病理进程。因此,为弄清疾病进程中的不同阶段,有哪些信号被激活,仍需要做大量的研究工作。目前认为分子(如IL-1β)及机械刺激两方面的因素影响着关节软骨细胞的动态平衡。这个连续的进程被暂时的、自分泌及旁分泌因素所打断,这个病理进程通过共同的病理途径,该途径涉及到细胞因子(IL-1β,TNFα),信号调停者(NO,PGE2,ROS),机械敏感基因(iNOS,COX-2, MMPs), MAPKs(p38、JNK、ERK1/2),转录因子(NFKB,AP-1)。机械刺激能开放半通道、引起ATP的释放,作为软骨细胞机械传导途径中的一部分。关节软骨与软骨下骨组织,在关节的正常活动中,总是受到一定的机械压力,合适强度的动态压力有利于软骨细胞的合成代谢,而静态压力使关节软骨退变。机械压力有不同的作用形式,包括流体剪切、压缩、拉伸,这些可能影响软骨细胞中由IL-1β激活的信号传导通路。IL-1β作为骨性关节炎发生的一种分子因素,是由有炎症的关节中的滑膜细胞与巨噬细胞产生的细胞因子,它能抑制细胞外基质的合成,促进细胞老化。本文研究在有或无炎症介质IL-1β存在的情况下,软骨细胞在不同频率振动刺激下的不同反应,即软骨细胞的合成与分解代谢基因的不同表达,从而了解机械振动对不同状态下的软骨细胞的作用。因此,生化及机械交叉诱导的信号传导途径为预防骨性关节炎的发生提供治疗策略,为细胞修复提供新的方法。二、材料与方法从两个月大小的新西兰兔的多个关节中获得软骨细胞,在6孔板中进行培养,待软骨细胞大致长满瓶底后(约2-3天),换液1次,将一半的孔中加入10ng/mlIL-1β(Peprotech Asia, USA),次日应用自制复合振动仪,将振动强度0.5 g(g为加速度),不同频段0、45、90 Hz振动应变分别作用于软骨细胞,30mins/d,应用自制复合振动仪,振动强度为0.5 g(g为加速度),使用三种不同的机械振动频率(0、45、90Hz)分别作用于培养的兔软骨细胞。此时,分子因素工L-1β与机械振动共同刺激下的兔软骨细胞可分成A-F六组：其中A表示IL-Vib-组,B代表IL+Vib-组,C表示IL-Vib45+组,D表示IL+Vib45+组,E表示IL-Vib90+组,F表示IL+Vib90+组。振动培养两天,末次振动后继续在细胞孵箱中放置1小时后,用RT-PCR检测软骨细胞中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、iNOS、COX-2、Aggrecan基因表达产量,RT-PCR即从兔软骨细胞中提取总RNA并合成cDNA。用TRIZOL试剂(美国Invitrogen公司产品)严格按说明书操作抽提总RNA测定浓度和纯度。PCR循环参数为：95℃预变性5分钟,95℃变性15秒,60℃退火15秒,72℃32秒,并采集荧光信号,40个循环。在PCR反应结束后,设定基线水平和阈值,ABI7500软件会自动绘制标准曲线,并根据标准曲线计算各样本的基因及管家基因的绝对拷贝数,从而可得出各个基因的相对表达量。结果用SPSS13.0统计软件,数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),用LSD法对各组数据进行多重比较,若经Levene检验,数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Dunnett T3法进行统计分析。p<0.05看作是有显著性差异。三、结果与结论在未给予炎性介质和或机械振动刺激下,正常兔软骨细胞有大量的Aggrecan、Ⅱ型胶原基因的表达,一定量的Ⅰ型胶原基因表达,同时也有少量的iNOS mRNA与COX-2mRNA表达。未给予机械振动刺激的前提下,10ng/ml的炎症介质工L-1β使软骨细胞中的iNOS、COX-2基因表达显著升高,使细胞中Ⅱ型胶原、工型胶原、Aggrecan基因产量下降。无炎性介质IL-1β的参与的情况下,频率为45HZ与90HZ的机械振动抑制兔软骨细胞中Aggrecan基因的表达(p<0.05),频率为45HZ与频率为90HZ的机械振动对软骨细胞Aggrecan基因表达的影响无显著差异(p>0.05)。相对于对照组,频率为45HZ、90HZ的机械振动对软骨细胞COX-2与iNOS基因的表达均无显著影响(p>0.05)；同时这两种频率对软骨细胞COX-2与iNOS基因的表达上进行相互比较,也未发现显著差异(p>0.05)。频率为45HZ的机械振动抑制Ⅰ型胶原基因的表达(p<0.05)；相对于频率为45HZ的振动,90HZ的机械振动促进Ⅰ型胶原的表达(p<0.05)。在无IL-1β的参与下,与对照组相比,45HZ的机械振动对Ⅱ型胶原的表达无显著影响(p>0.05),而90HZ的机械振动能显著促进软骨细胞中Ⅱ型胶原基因的表达(p<0.05)。在浓度为10ng/ml炎性介质L-1β存在的条件下,相对于OHZ频率,45HZ的机械振动抑制软骨细胞中Ⅱ型胶原与Aggrecan基因的表达(p<0.05),90HZ的机械振动对软骨细胞中Ⅱ型胶原与Aggrecan基因的表达无显著影响(p>0.05)。而相对与45HZ的振动频率,90HZ的机械振动对Ⅱ型胶原基因表达有显著的促进作用(p<0.05)。IL-1β存在的条件下,45HZ与90HZ频率的机械振动能抑制iNOS mRNA、COX-2 mRNA的表达(p<0.05)。但45HZ与90HZ这两种频率的机械振动对iNOS基因的表达量无显著差异(p>0.05)。对于抑制COX-2mRNA的表达而言,与45HZ的机械振动相比,频率为90HZ的机械振动更能抑制COX-2基因表达,其表达产物产生更少(p<0.01)；相对于OHZ,45HZ或90HZ的机械振动对Ⅰ型胶原基因表达无显著影响(p>0.05),45HZ与90HZ的机械振动之间对产物的抑制无显著差别(p>0.05)。与此同时,我们发现不管有无IL-1β的参与,随着机械振动频率的升高,软骨细胞中Ⅱ型胶原与Aggrecan表达产物均有升高的趋势。本试验提示炎症介质工L-1β能使兔软骨细胞老化,合适频率的机械振动能促进特定环境中细胞的合成,抑制软骨细胞的去分化,从而为预防骨性关节炎的发生提供治疗策略,同时也为细胞修复提供新的方法。四、课题创新点目前关于机械振动在预防骨质疏松方面(即成骨作用)的研究较多,但振动对软骨细胞作用的研究很少。目前还没有文献报道过IL-1β与机械振动共同对软骨细胞的p38MAPK信号传导途径的影响。