细胞凋亡(apoptosis)也称程序化细胞死亡(programmed cell death, PCD),是生物体内绝大多数细胞在一定发育阶段由基因调控的、自主的、有序的死亡过程,它对于组织进化、器官发育和机体自身稳定的维持起着重要作用。激光光镊拉曼光谱技术(LTRS)是将激光镊子技术和拉曼光谱技术结合起来并应用于悬浮细胞、细胞器、大分子颗粒研究的一项生物光子技术,具有非破坏性,非标记性,检测速度快等优点,LTRS可以实时、无损伤测定细胞受胁迫后单个细胞以及胞外线粒体动态的生理生化变化过程。铝胁迫是酸性土壤中影响植物生长和限制作物产量的一个主要因子。铝对生物毒害之一是导致细胞凋亡,植物遭到铝胁迫后,细胞中的线粒体和Cyt c及Caspase在激活细胞凋亡中起重要作用。本研究前期工作也发现铝胁迫可以导致土生隐球酵母发生细胞凋亡现象,但是铝诱导土生隐球酵母发生细胞凋亡的机制,铝胁迫与细胞内凋亡信号之间传递的联系还不十分清楚。本研究利用LTRS技术实时检测铝胁迫下酵母细胞和线粒体的动态过程以及测定铝胁迫下酵母和大豆根尖细胞线粒体生理生化变化,同时还通过透射电子显微镜和DAPI染色观察铝胁迫下酵母细胞细胞核、线粒体等细胞器的变化,从而加深对线粒体及Cyt c在细胞凋亡调控中的认识。主要研究结果如下：(1)以土生隐球酵母为研究材料,运用LTRS技术分析铝诱导单个酵母细胞凋亡时细胞内生物大分子的信息变化过程。结果显示,在200mmoL L铝处理下,归属于核酸的拉曼峰(721,1083,1301 cm-1)、归属于蛋白质的拉曼峰(721,872,1445,1604,1657 cm-1)和归属于脂类(1301,1445,1746 cm-1)的拉曼峰的峰强度都随处理时间的延长而显著降低,说明酵母细胞凋亡过程中细胞内的核酸、蛋白质和脂类的含量均减少。通过1604 cm-1峰强度降低的变化,可以得出线粒体功能降低造成细胞能量代谢受阻的信息。铝诱导酵母细胞凋亡过程中,LTRS可以对单个的酵母细胞生理变化过程实时记录下来,得到细胞凋亡过程胞内生物大分子变化的实时信息,这些信息真实地反映了其个体凋亡过程的生理生化过程,能够克服基于群体细胞水平上研究细胞动态过程中某些生物大分子变化信息被掩盖的缺点,是一种在单个细胞水平上实时监测细胞凋亡过程的有效方法。(2)铝胁迫酵母细胞后提取其线粒体,运用LTRS实时监测线粒体拉曼光谱,并结合常规方法测量线粒体生理生化变化,分析铝胁迫酵母线粒体内生物大分子的信息变化过程。结果显示,与脂类相关的谱峰(1064、1130、1301、1445、1657和1746 cm-1)的峰强度随铝处理浓度增大和处理时间的延长而显著降低。而用常规法测定发现,酵母线粒体中丙二醛(MDA)的含量随着铝处理浓度的增加和处理时间的延长而增加,这说明线粒体膜脂受到氧化损伤或者降解,导致了线粒体内的脂类含量减少,线粒体质膜受损。线粒体内与Cyt c相关的特征峰(750和1130 cm-1)的强度随铝处理浓度增大和处理时间的延长而显著降低,其Cyt c的含量减少,与常规法测定线粒体Cyt c/a和Cyt c的含量结果是相似的,说明酵母线粒体膜因为铝胁迫发生肿胀,导致膜破裂,Cyt c释放到线粒体外。1604cm-1是线粒体的呼吸峰,随着铝浓度的增加和处理时间的延长,1604 cm-1这个呼吸峰随之降低,其线粒体的活性不断减弱,能量代谢不断受到阻碍。与常规方法测定线粒体膜电位(△Tm)结果降低是一致的。归属于核酸的谱峰(1081和1301 cm-1)和蛋白质谱峰(750、872、1004、1031、1445、1604和1657 cm-1)的强度随着铝浓度增大和处理时间延长而显著降低。这些结果说明了细胞凋亡过程中线粒体膜受损,核酸、蛋白质和脂类含量均减少。(3)在细胞水平通过透射电子显微镜和DAPI染色来观察铝胁迫下酵母细胞细胞核及线粒体等细胞器发生的变化,细胞核在细胞边缘聚集,核内的染色质凝聚呈新月状分布在核内周边,呈致密浓染。线粒体形状发生变化,结构遭到破坏。在分子水平通过设计土生隐球酵母Cyt c基因的引物分析基因的表达谱,细胞中Cyt c基因表达水平随铝浓度和处理时间的增加而升高,这反映了铝胁迫可以诱导Cyt c的表达。同时观察到铝处理后土生隐球酵母基因组发生降解、细胞内活性氧ROS升高、caspase-3-like酶活性增加,这些研究结果进一步说明了铝诱导土生隐球酵母发生细胞凋亡过程中发生的一些典型特征变化及ROS、Cyt c和caspase-3在该过程中具有一定的作用。(4)以丹波黑大豆为研究材料,测定了铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体的生理生化特性变化。结果显示,铝处理大豆根尖时,根尖细胞线粒体MDA含量随着铝浓度增大和处理时间延长而显著增加,线粒体Cyt c/a的比值、线粒体Cyt c的含量和线粒体膜电位(△Ψm)呈下降趋势。这说明,铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体膜电位(△Ψm)降低,线粒体膜的完整性被破坏,促使Cyt c从线粒体内膜上脱落下来,线粒体中的Cytc/a和Cyt c含量减少,Cyt c有可能通过线粒体膜从线粒体释放到细胞质中。在细胞水平通过DAPI染色来观察铝胁迫下大豆根尖细胞细胞核的变化,发现细胞核在细胞边缘聚集,核内的染色质凝聚呈新月状分布在核内周边,呈致密浓染。在分子水平通过设计丹波黑大豆Cyt c基因引物分析铝浓度梯度和时间梯度的表达谱,细胞中Cyt c基因的表达水平随铝浓度和处理时间的增加而升高,这从基因水平反映了铝胁迫可以诱导大豆根尖细胞内Cyt c的表达。铝胁迫大豆根尖细胞后其基因组发生降解、活性氧ROS升高、caspase-3-like酶活性升高,这说明了铝诱导丹波黑大豆发生细胞凋亡时发生的一些典型特征变化及ROS、Cyt c和caspase-3在该过程中具有一定的作用。