杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)几丁质酶功能研究

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几丁质是自然界中储存量第二的天然多糖,在医学上的应用日益受到人们关注。几丁质酶是可以将几丁质高效降解为寡糖甚至单糖的糖基水解酶。弧菌科大部分细菌能够产生几丁质酶,硅藻和真菌等细胞壁中有几丁质,本研究基于这一点,通过基因敲除、还原糖检测等手段,探究细菌是否能够通过分泌几丁质酶来抑制相关藻类、真菌等。杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)属于海洋细菌弧菌科的一种,它能够产生几丁质酶。本研究将杀鲑气单胞菌编码几丁质酶的基因敲除,然后对比野生株与敲除株在降解几丁质、抑制含有几丁质外壳的硅藻、真菌的能力变化来探究几丁质酶在几丁质循环中的作用。本研究首先通过二硝基水杨酸法法(DNS)还原糖检测法对杀鲑气单胞菌野生菌和敲除菌其降解几丁质能力进行检测,杀鲑气单胞菌野生株降解的几丁质荧光检测结果为12小时560nm处OD值为0.125,24小时OD值为0.209,48小时OD值为0.283;杀鲑气单胞菌敲除株12小时OD值为0.000,24小时OD值为0.002,48小时OD值为0.007,对比判断得出几丁质酶敲除株丧失降解几丁质的能力。由于在海洋中细菌与硅藻并非共生关系,我们推测细菌能够对含有几丁质外壳的硅藻表现出趋化性,所以我们对这一猜想进行验证,通过涂布平板法,将牟氏角毛藻(Chaetoceros meuller)滴于含有细菌细胞的琼脂平板上,12小时观察后发现杀鲑气单胞菌确实会向有硅藻的方向聚集,验证了该细菌对硅藻具有趋化性。接下来我们检测了细菌的杀硅藻活性,方法是将野生株、敲除株分别与硅藻共同培养24小时之后,使用酶标仪检测培养物中的藻类荧光,检测结果是对照组硅藻平均荧光强度为274,细菌浓度0.3%组为270,细菌浓度0.5%组为273,细菌浓度1.0%组为261,细菌浓度2.0%组为243,细菌浓度5.0%组为201。结果显示野生株细菌处理的硅藻在细菌浓度达到1.0%时荧光强度有明显降低,并且细菌浓度越高,杀藻活性越强,于是选取2.0%作为后续实验浓度。将野生株与敲除株分别处理硅藻24小时,并检测荧光,其结果为对照组硅藻平均荧光强度为403,野生株处理硅藻荧光强度为366,敲除株处理硅藻荧光强度为403相对于对照组荧光强度相同。因此,敲除株细菌是失去了杀藻活性的,从而证明了几丁质酶在细菌杀藻过程中起到了关键作用。最后我们将杀鲑气单胞菌野生株与敲除株分别与硅藻共培养并将其过程在扫描电镜下可视化呈现,发现野生株杀鲑气单胞菌能够附着在硅藻的表面并裂解其几丁质外壳从而杀死硅藻;而敲除株虽然也能够附着在硅藻表面,但是硅藻整体并无碎裂现象。同样的,因为真菌细胞壁中也含有几丁质,所以本研究同样使用杀鲑气单胞菌对水霉菌(Saprolegniasis)进行感染。在细菌对真菌的感染实验中,本研究通过牛津杯法对比验证其抑菌效果,结果显示加有野生株细菌的牛津杯中真菌的生长受到明显的抑制,而加有敲除株细菌的牛津杯中并无明显的抑制曲线。这证明了野生株杀鲑气单胞菌对真菌的生长具有抑制作用,而敲除株对真菌的生长无抑制作用。通过扫描电镜观察发现,杀鲑气单胞菌野生株与敲除株均可以附着在真菌细胞壁上,但是由于真菌细胞壁中所含几丁质位于细胞壁内侧,所以没有发现细胞壁裂解现象。为了进一步了解几丁质对于弧菌的影响,本研究通过平板法,配制成分不同的培养基培养弧菌,发现弧菌属的细菌(副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio Anguillarum))在环境缺乏碳源时,能够以几丁质作为碳源来源维持繁衍;而当环境中中营养成分充足的时候,几丁质会抑制弧菌科细菌的生长。通过将杀鲑气单胞菌野生株、敲除株对硅藻、真菌的感染实验,本研究最终得到结论,几丁质酶在细菌抑制硅藻、真菌的过程中起到关键性作用,对于藻类的开发和保护以及真菌病原体的防治具有重大参考价值。
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