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中药是我国传统医药学宝贵的财富,对中国乃至世界医药学的发展做出了重大的贡献,但由于中药作用机理的复杂性,多数中药的体内代谢过程目前尚不明确,使得其在临床应用方面缺少科学依据。目前临床上中药与化药,中药与中药之间的联合应用日渐普遍,有关其所导致的不良反应事件的报道明显增多,目前对于中药及其有效成分的研究已经成为热点。黄芩苷(Baicalin,BG)别名黄芩甙,是从唇形科多年生双子叶草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根中提取的一种黄酮类单体化合物,是黄芩药理作用发挥的主要物质基础之一。黄芩苷生物活性显著,具有抗菌、利胆、解热、降压、抗氧化、抗HIV病毒以及抗肿瘤等作用。二十世纪七十年代以来,我国开始将黄芩苷制成各种类型的制剂,在临床上广泛应用并取得了很好的疗效。随着黄芩苷及其制剂广泛使用,临床上与其他多种药物联合应用的机会越来越多,故黄芩苷与其它药物发生相互作用风险的比率也越来越高,安全性问题日渐突出。药物对CYP450酶的诱导或抑制作用是引起药物相互作用发生的主要原因之一,而药物间的相互作用是导致不良反应发生的重要因素,其中代谢性药物相互作用的发生率所占的比例最高。细胞色素P450酶是药物在体内氧化代谢的重要酶系,参与进入机体约90％的药物代谢,其中CYP3A酶在肝脏中占近1/3的比例,是CYP450酶系中重要的亚型。有关中药复方制剂对CYP450酶的影响研究报道较多,中药有效成分对CYP450酶影响的研究较少,因此,进一步加强中药有效成分黄芩苷对CYP450酶的影响研究具有很大的实用价值。
目的：本研究采用体外和体内实验研究黄酮类单体化合物黄芩苷对大鼠肝CYP3A酶的活性的影响,从而阐明和评价黄芩苷对大鼠肝CYP3A酶的作用,指导临床合理有效用药。
方法：⑴制备大鼠肝微粒体断头处死大鼠,即刻取出肝脏,用4℃预冷的Tris-HCL缓冲液反复冲洗,应用钙沉淀法进行大鼠肝微粒体的制备,保存于液氮。⑵测定大鼠肝微粒体蛋白的含量采用Bradfrod法进行大鼠肝微粒体蛋白含量的测定。⑶孵育反应 CYP3A酶的孵育体系总体积250μL,反应体系包含肝微粒体蛋白,NADPH,MgCl2,EDTA,磷酸盐缓冲液和探针药物咪达唑仑,在37℃水浴中进行反应。分对照组和实验组,对照组加等体积磷酸盐缓冲液,实验组加黄芩苷。预孵育5min后加NADPH启动反应。⑷色谱条件Diamonsil C18(200×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相为甲醇:乙腈:水=53:13:34;流速1ml·min-1;柱温25℃;检测波长220nm;进样量:20μL。⑸咪达唑仑方法学考察按照生物样品的测定要求,对大鼠肝微粒体中咪达唑仑测定方法的专属性、精密度、回收率、稳定性进行考察。⑹黄芩苷方法学考察建立大鼠肝微粒体中黄芩苷的HPLC测定方法,并考察方法的专属性、精密度、稳定性等。HPLC色谱条件:5μm Diamonsil C18(200×4.6mm)色谱柱;流动相为甲醇:水:磷酸=53:47:0.2;流速1ml·min-1;柱温25℃;检测波长278nm;进样量为25μL。⑺给药方案将22只雄性SD大鼠,随机分为对照组和实验组,实验组每天给予尾静脉注射黄芩苷(900mg·kg-1),对照组每天给予尾静脉注射相同剂量的生理盐水注射液,均连续给药12d,于末次给药后4h断头处死,取肝脏。⑻制备大鼠肝微粒体断头处死大鼠,立即取出肝脏,用预冷的Tris缓冲液反复冲洗,采用钙沉淀法制备肝微粒体,液氮保存。⑼测定微粒体蛋白的含量选用Bradfrod法进行微粒体蛋白含量的测定。⑽孵育反应孵育体系总体积为250μL。反应体系包含肝微粒体蛋白,NADPH,MgCl2,EDTA,磷酸盐缓冲液和探针药物(咪达唑仑),在37℃水浴中进行反应,分对照组和实验组。预孵育5min后加NADPH启动反应,反应时间为20min。⑾统计分析方法采用SPSS10.0软件进行数据的统计分析,用t检验将实验组和对照组相比较,P＜0.05认为有统计学意义。
结果：①探针药物的方法学考察肝微粒体中的杂质不干扰咪达唑仑的测定,日间和日内变异系数均小于15%,肝微粒体中咪达唑仑的线性范围是1.25～80.00μmol·L-1,以峰面积(Y)对大鼠肝微粒体中MDZ的浓度(X)做回归计算,得到回归方程:Y=0.0097X-0.2936,标准曲线的相关系数为0.9998:结果表明,方法的精密度、灵敏度和稳定性等均满足生物样品的分析要求。②黄芩苷方法学考察肝微粒体中的杂质不干扰黄芩苷的测定,其日间、日内变异系数均小于15%,肝微粒体中黄芩苷的线性范围是1.5625～50μmol·L-1,以峰面积X对大鼠肝微粒体中黄芩苷的浓度Y做回归计算,得到回归方程:Y=0.0389X+0.5319,标准曲线的相关系数为0.9998:结果表明,方法的精密度和灵敏度等均满足生物样品的分析要求。③黄芩苷对大鼠肝CYPSA的IC50实验考察了黄芩苷对大鼠离体肝CYP3A酶的影响,大鼠肝微粒体孵育体系中黄芩苷系列浓度为28,56,98,112,168和2241μmol·L-1,探针药物咪达唑仑终浓度为10μmol·L-1,结果显示,上述系列浓度的黄芩苷对CYP3A酶有抑制作用,抑制率分别为17.47%,41.28%,62.13%,75.95%,80.55%和90.62%,IC50为67.81μmol·L-1,黄芩苷对大鼠离体肝CYP3A有显著抑制作用。④CYP3A酶活性测定连续尾静脉给予大鼠黄芩苷(900mg·kg-1)12d后,对照组咪达唑仑转化率为(705.97±128.09)pmol·min-1·mg-1,实验组咪达唑仑转化率为(529.51±169.53)pmol·min-1·mg-1,实验组大鼠肝CYP3A酶的活性显著低于对照组(P＜0.05),探针药物咪达唑仑的代谢减少了约25.00%。⑤CYP3A酶的相关酶动力学参数黄芩苷(900mg·kg-1)连续尾静脉注射给予大鼠12d后,对照组CYP3A代谢咪达哗仑的酶动力学参数Km为(30.35±0.43)μmol·L-1,Vmax为(2.65±0.03)nmol·mg-1·min-1,Clint为(87.31±0.87)μL·mg-1·min-1;实验组Km为(32.76±0.47)μmol·L-1,Vmax为(2.37±0.02)nmol·min-1·mg-1,Clint为(72.21±1.04)μL·mg-1·min-1,统计结果表明,实验组大鼠肝CYP3A酶的活性显著低于对照组(P＜0.05),黄芩苷连续多次用药对CYP3A酶的活性有显著抑制作用。
结论：⑴黄芩苷可显著抑制大鼠离体肝微粒体CYP3A酶的活性。⑵黄芩苷连续多次用药对大鼠肝CYP3A酶有明显抑制作用。