小黑豆乳清蛋白和多肽的提取及其功能性研究

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本文以小黑豆为原料得到的小黑豆乳清水。经膜技术分离纯化后得到小黑豆乳清蛋白。利用单酶水解和双酶复合酶解法制备小分子乳清多肽,通过体外抗S180和H22肿瘤细胞实验筛选出抗肿瘤效果好的多肽。对该多肽和蛋白的体内免疫功能、抗S180肿瘤、抗皮肤乳头瘤和抗化学性肝癌进行了系统研究。结果表明:1、试验用絮凝离心法对小黑豆乳清水进行预处理,最佳工艺条件为:pH8.0、CaCl2加入量15ml·-1、温度40℃。再经微滤、超滤得到小黑豆乳清蛋白。经Sephadex G-50凝胶分析表明,本工艺制得的小黑豆乳清蛋白分子量范围在6.0KD-10.0KD的占到50.3%,高于10.0KD的大分子约占45%。2.小黑豆与黄大豆乳清水和蛋白组成的比较分析表明,小黑豆乳清水中的乳清蛋白、灰分、总糖含量均高于大豆乳清水;通过电泳分析表明,小黑豆乳清蛋白和大豆乳清蛋白的分子量主要分布在30.0KD以下,小黑豆乳清蛋白中的BBI含量高于大豆乳清蛋白。3、以小黑豆乳清蛋白为底物,用单一蛋白酶和双酶复合酶解制备小黑豆乳清多肽。细菌酸性蛋白酶单酶水解制备的多肽得率最高,可达97%。双酶复合水解多肽得率最高的为先胃蛋白酶处理后细菌酸性蛋白酶处理,其多肽得率为63.36%。经SephadexG-25凝胶层析分析表明,本工艺所得乳清多肽的主要成分是小于1KD的多肽,占80%以上。4、本研究对多种多肽进行体外抗肿瘤实验,得到以下结论:木瓜蛋白酶水解制备的多肽对S180、H22肿瘤细胞的抑制效果最显著。针对这一最佳抗肿瘤效果,设计了木瓜蛋白酶水解制备多肽的正交试验,得到最佳多肽制备工艺为:加酶量5000U/g蛋白,pH6.0,处理温度为65℃。5、本研究对小黑豆乳清蛋白及多肽进行免疫功能试验。试验发现,小黑豆乳清蛋白及多肽对小鼠免疫器官无明显抑制作用。在相同剂量时,75℃处理组抑制荷瘤小鼠各项免疫功能下降的作用明显好于65℃处理,且呈一定的量效关系;多肽组提高免疫效果优于蛋白组,但多肽剂量与抗肿瘤效果呈负相关关系。6、用乳清蛋白及多肽饲喂小鼠,进行抗S180、抗皮肤乳头瘤和抗肝癌前期病变实验。抗S180结果显示,75℃蛋白高剂量组抗肿瘤的效果优于65℃蛋白组,抑瘤率达41.8%。蛋白和多肽高剂量组的抑皮肤乳头瘤效果较好,抑瘤效果与蛋白或多肽的浓度呈正相关。抗肝癌的结果显示,Prote AX多肽组抑制肝癌细胞生长的效果优于木瓜多肽组,抑癌效果与多肽浓度呈正相关。小黑豆乳清蛋白及多肽均有预防肿瘤的作用。
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