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目的:p53是最重要的抑癌基因之一。新发现的ASPP (Apoptosis stimulating protein of p53 )家族是能特异性地调节p53抑癌功能的蛋白质。其中iASPP (inhibitory member of the ASPP family)是最近发现的能特异抑制p53抑癌功能的蛋白,iASPP与p53结合能干扰p53的诱导细胞凋亡能力,因此是p53的重要抑制蛋白。现已在多种肿瘤细胞中发现iASPP过高表达的现象,提示抑制iASPP的高表达有可能成为恢复p53抑癌功能的新策略。最初报导的iASPP长度为351个氨基酸,但我们最初的克隆实验发现编码351个氨基酸的iASPP(1056 bp)并不是全长iASPP基因,经过生物信息学比对得到iASPP的全长基因的CDS应为2487 bp,原来报导的短iASPP可能是全长iASPP的变种或截短形式。由于以前的研究都是基于短的iASPP序列进行的工作,而全长iASPP才是体内的主要存在形式,因此有必要对全长iASPP的功能进行研究,而克隆全长iASPP基因是功能研究的基础。本实验利用RT-PCR、PCR的方法分段扩增了全长iASPP基因,同时构建了iASPP的真核表达载体,并将其通过脂质体转染到肿瘤细胞株中,经过RT-PCR和Western Blot等方法观察阳性质粒对iASPP mRNA及蛋白表达的影响,最后检测了转染iASPP质粒前后肿瘤细胞株凋亡的变化。为进一步研究全长iASPP的功能奠定了基础。方法:1.培养人白血病细胞株HL-60,并提取其总DNA、RNA。根据GenBank中iASPP的序列,设计特异性引物,应用RT-PCR和PCR的方法分三段扩增iASPP基因,将三段基因拼接成全长的iASPP基因,测序。2.在全长的iASPP基因两侧加入酶切位点HindⅢ/EcoRⅠ,克隆至pMD19-T载体,并亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+) ,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP。3.用脂质体将测序正确的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP转染至结肠癌细胞株SW480、lovo中,用RT-PCR、Western Blot方法检测iASPP的表达以及用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化情况。结果:1.用PCR技术克隆短iASPP时,测序后发现有三个位点与报导的序列不一致,重复实验结果证明确实有三个位点与原序列不同。当使用生物数据库Blast比对时,发现有许多克隆片断与我们得到的的序列重叠部分是完全一致的,从而确认了正确的全长iASPP序列。2.为了克隆全长iASPP,首先经PCR和RT-PCR获得了iASPP的三个片断,经测序与目的序列一致;将三个片断拼接后获得一个长2516bp的片断,经测序与目的序列完全一致。3.克隆得到质粒pMD19-T-iASPP,经酶切后插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建了重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,经酶切测序与GenBank上登陆的人iASPP cDNA序列(gi 60457962)完全一致。4.经pcDNA3.1(+)-iASPP质粒转染的结肠癌细胞株SW480、lovo的mRNA和蛋白表达均增高,细胞凋亡率下降。结论:1.发现人体内iASPP存在着不同长度的形式,以前研究的短iASPP可能是全长iASPP的变种或截短形式。2.成功扩增人iASPP全长基因,重组人iASPP全长CDS克隆成功,并成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP。3.重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP在结肠癌细胞株SW480、lovo中获得了表达。4.转染重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP后的结肠癌细胞株SW480和lovo凋亡率下降,证明全长iASPP有抑制p53的诱导细胞凋亡的能力。提示抑制iASPP高表达有可能成为恢复p53抑癌功能的新策略。