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鸡传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的病毒性传染病，也是鸡的一种重要的免疫抑制病。IBDV的感染除引起鸡群发病死亡，造成生产性能下降外，还导致严重的免疫抑制，使鸡群免疫机能降低，对其它疫苗的免疫应答能力降低。IBD的控制主要靠疫苗免疫为主，80年代IBDV超强毒株的出现，常常引起免疫鸡群发病，使IBD的防制面临新的挑战。IBDV属双RNA病毒，目前有关病毒蛋白在病毒复制中的作用研究还不太清楚，开展这方面的研究对预防IBDV有重要意义。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是近几年发展起来的分子生物学新技术，已被广泛应用于病毒感染性疾病治疗、预防和基因功能研究。为了有效预防IBD，探讨新的防制策略；更深入的研究IBDV编码蛋白在病毒复制中的作用，进行了如下三方面的研究：1、质粒介导的RNAi抑制IBDV复制的研究针对IBDV VP1基因的保守区，设计了3个特异siRNA序列(siVP1618、siVP11115和siVP12571)。采用体外转录方法合成并转染Vero细胞，6h后感染IBDV，60h后收获病毒悬液测定病毒毒价。病毒蚀斑形成试验结果显示，与对照组(siRNACon)相比，siVP1618、siVP11115和siVP12571组对IBDV复制的抑制率分别为84％、86.7％和93.3％。荧光定量PCR检测结果显示，与对照组相比，siVP1618、siVP11115和siVP12571组转染细胞中病毒mRNA分别降低了30.4％、94.7％和98.2％。综合病毒蚀斑形成试验和荧光定量PCR检测结果，siVP12571对IBDV复制的抑制效果最好。为了使siRNA获得长久表达并适合于大量制备，选取siVP12571序列设计引物，扩增鼠U6启动子后反向克隆入pEGFP-C1载体的DraⅢ和MluⅠ位点，构建了shRNA表达载体pEC2571-shRNA。将shRNA表达质粒转染Vero细胞后感染IBDV，通过病毒蚀斑形成试验和荧光定量PCR检测其对IBDV复制的抑制效果。病毒蚀斑形成试验结果表明，与对照组相比，pEC2571-shRNA转染组对IBDV复制的抑制率为87.4％；间接免疫荧光分析（indirect immunofluorescent assay，IFA）pEC2571-shRNA处理细胞的IBDV VP1蛋白阳性细胞比对照的明显减少；荧光定量PCR结果显示病毒mRNA降低了90.7％。检测结果表明shRNA表达载体pEC2571-shRNA转染到细胞中能有效地抑制1BDV的复制。2、VP3蛋白在病毒复制中的作用研究为了研究IBDV VP3在病毒复制、病毒粒子装配过程中的作用，通过RNAi技术抑制VP3蛋白表达，检测其对病毒滴度和VP2结构蛋白表达的影响。本研究针对VP3基因设计并合成了3个siRNA序列(siVP3222、siVP3324和siVP3448)，与表达VP3-EGFP融合蛋白的pEGFP-VP3真核表达质粒共转染Vero细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪检测其对VP3蛋白表达的抑制作用。荧光显微镜观察结果表明，siVP3324和VP3-EGFP质粒共转染的细胞中荧光表达细胞数最少，siVP3222次之。流式细胞仪检测结果表明，与对照组相比，siVP3222、siVP3324和sivP3448对VP3蛋白表达抑制率分别为：93％、97％和48.5％。荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果表明siVP3324对VP3蛋白表达具有较好的抑制效果。选取siVP3324序列设计引物，扩增鼠U6启动子后反向克隆入pEGFP-C1表达载体，构建了shRNA表达载体pEC324-shRNA。将pEC324-shRNA质粒转染Vero细胞后感染IBDV，通过病毒蚀斑形成试验检测其对IBDV复制的抑制效果，通过荧光定量PCR检测VP2和VP3蛋白mRNA合成情况。与对照组相比，pEC324-shRNA表达质粒转染组对IBDV复制的抑制率为86.9％；VP2和VP3蛋白的mRNA表达水平减少了35.3％和91.2％。结果表明pEC324-shRNA明显抑制了VP3的合成，而对VP2的影响较弱，证明pEC324-shRNA的抑制作用是特异的。本研究通过RNAi技术在病毒繁殖过程中抑制了VP3蛋白的表达，结果使病毒复制能力明显降低，其主要原因可能是由于VP3蛋白减少导致病毒粒子装配能力下降所致。这些结果表明VP3蛋白在病毒复制中起重要作用。3、VP5蛋白对病毒复制的影响针对VP5基因设计了3个siRNA序列(siVP525、siVP540和siVP5227)，采用体外转录方法合成，转染Vero细胞后接种IBDV。病毒滴度检测结果表明，siVP525、siVP540和siVP5227对IBDV的抑制率分别为：6.8％、0％和56.0％。转染稳定表达VP5蛋白的Vero细胞系，结果表明siVP540对VP5蛋白表达的抑制作用最明显，siVP525次之。与表达VP5-EGFP融合蛋白的pEGFP-VP5真核质粒共转染Vero细胞，检测结果与转染稳定表达VP5蛋白的Vero细胞系的一致，siVP540对VP5蛋白表达的抑制作用最明显。siVP540可以有效抑制VP5蛋白的表达，但并没能抑制IBDV的复制，这表明VP5蛋白是病毒复制所非必需的。本研究探讨了利用RNA干扰技术抑制IBDV的复制，为该病的防制提供了新思路。首次在病毒繁殖过程中抑制了VP3和VP5蛋白的表达，证明VP3蛋白在病毒复制中起重要作用，进一步证实VP5蛋白是病毒复制所非必需的。这些结果为病毒复制机理的研究提供了新线索。