【摘 要】
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目的:探究咖啡因在体外对肝星形细胞的直接作用及机制。方法:选取人肝星形细胞系LX-2进行体外实验,经浓度为0mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM、30mM的咖啡因处理所设定时间后,用C
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目的:探究咖啡因在体外对肝星形细胞的直接作用及机制。方法:选取人肝星形细胞系LX-2进行体外实验,经浓度为0mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM、30mM的咖啡因处理所设定时间后,用CCK-8试剂和流式细胞仪分别检测细胞活性和凋亡细胞百分数;用Western blot法测定内质网应激和细胞自噬的标志蛋白;用透射电镜观察细胞自噬小体和肿大的内质网;用激光共聚焦显微镜测定GFP-RFP-hLC3慢病毒稳转LX-2细胞中绿色荧光和红色荧光强度;用siRNA敲低细胞中ATG7和IER1-α蛋白。结果:咖啡因作用后,LX-2细胞活性降低同时凋亡细胞百分比增加,此作用呈时间和浓度依赖性;内质网应激标志性蛋白(GRP78/Bip,CHOP and IER1-α)表达量增加,同时电镜观察到肿大的内质网数量增多,内质网应激增强;LC3Ⅱ表达量增加,P62表达量降低,并且绿色荧光和红色荧光的点状聚集增多,同时电镜观察到的自噬小体数量增多,自噬增强。敲低IER1-α基因表达量后,LX-2细胞自噬流强度降低;分别用ATG7-siRNA和3-MA抑制LX-2细胞自噬后,凋亡细胞百分比减小。结论:咖啡因增强内质网应激中IER1-α信号通路诱导LX-2细胞自噬,从而增加凋亡细胞数和减弱细胞活性,此机制的阐明加深了对咖啡因抗纤维化作用机制的认识。
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