目的：培养出不同年龄组血管平滑肌细胞(VSMCs)，探讨VSMCs年龄相关的衰老过程，进而探讨在BKCa活性改变时细胞衰老相关因子P16INK4a表达及细胞增殖，旨在揭示BKCa与VSMCs衰老关系。 方法：1．实验动物：健康雄性SD大鼠，年轻组与老年组各20只。2．细胞培养与鉴定：①无菌操作下，取出主动脉，转移至冷PBS，去血管外膜、内膜，剪碎中膜成糊状，0.2％Ⅱ型胶原酶溶液(20％FBS的DMEM/F12配制)消化，分离细胞，在37℃、饱和湿度、5％CO2环境下，生长至90％-100％，胰酶与EDTA混合溶液消化，按比例1:3传代；取对数生长期细胞(80％-90％融合)，离心，含10％DMSO冻存液重悬，约5×106/管加入冻存管，置液氮中冻存。需要复苏时，首先将冻存管从液氮中取出，迅速复温，用新鲜配置培养基稀释，离心、重悬、吸入培养瓶，37℃CO2孵箱孵育。②鉴定：免疫细胞化学方法鉴定平滑肌细胞α-actin。3．对VSMCs做细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色：制备老年组、年轻组的第2、6、11代细胞爬片，用SA-β-gal工作液染色，显微镜下计数蓝染阳性细胞，计算衰老细胞率。4．MTT测定的不同浓度BKCa开放剂、阻断剂组及开放剂媒介组培养24h、48h、72h在波长为490nm下吸光度，计算抑制率及促进率，确定药物干预浓度。5．免疫细胞化学染色检测P16INK4a表达：青年组与老年组VSMCs 4％多聚甲醛固定；0.3％ TritonX-100透细胞处理后，与抗p16INK4a抗体4℃孵育过夜，与二抗室温孵育30min，DAB显色，倒置显微镜下计数阳性细胞。6．统计分析：计数资料用Fishers确切概率法检验。计量资料均经方差齐性检验，两组间均数比较采用方差分析，多样本均数两两比较采用LSD检验或Tamhane t检验。P<0.05或P<0.01认为有统计学意义。 结果：1．血管平滑肌细胞培养与鉴定①形态学：倒置显微镜下，细胞形态为长梭形，呈现平滑肌细胞典型的“峰谷”样生长。②免疫细胞化学染色：胞浆内黄染，细胞纯度在95％以上。③不同年龄组血管平滑肌细胞培养成功率没有统计学差异。2．细胞衰老β-半乳糖苷酶染色：衰老细胞细胞变大、变得不规则；β-半乳糖苷酶染色胞浆呈深蓝色。衰老细胞数量随代龄增加而增加(P<0.05)；第6、11代龄，老年组衰老细胞阳性率较年轻组高。3．MTT检测细胞增殖活性：①NS1619媒介组与NS1619空白对照组之间差异无统计学意义。提示可以使用助溶剂DMSO以终浓度体积比0.3％配制NS1619，对细胞的生长影响没有统计学意义。②IBTX在一定范围以时间、浓度依赖方式抑制VSMCs增殖，同时有浓度饱和现象。③NS1619以时间、浓度依赖方式促进平滑肌细胞增殖。4．BKCa活性对VSMCs中P16INK4a表达的影响①阻断BKCa：阳性细胞胞质深黄染；无论老年组还是年轻组大鼠VSMCs P16INK4a表达阳性率增加，老年组较年轻组P16INK4a表达增加明显。②NS1619作用后，青年组与其对照组相比较P16INK4a表达无统计学意义；老年组与起对照组比较P16INK4a表达呈下降趋势，但差异无显著统计学意义；老年组相对于青年组无统计学意义。 结论：1．Ⅱ型胶原酶消化法可以成功培养出不同年龄组大鼠主动脉VSMCs，为研究老年动物体外培养细胞生物学特性及血管老化及相关疾病提供实验细胞。2．我们发现培养的VSMCs，在本质上就深深烙上年龄因素的印迹，后者直接影响细胞的增殖潜能与衰老，这也许能为研究体内非增殖细胞的衰老与血管老化及相关疾病提供新的思路。3．阻断BKca，VSMCs增殖受到抑制；反之，促进VSMCs增殖。提示BKca在VSMCs的增殖起重要作用。4．BKCa活性改变影响细胞增殖，BKCa可能参与细胞衰老进展速度的调节，可能通过或部分通过细胞衰老相关因子P16INK4a表达上调或下调实现。