研究目的和背景：近40年来,随着体外循环CPB技术和心肌保护方法的发展,在体外循环下进行冠状动脉搭桥术(ONCAB)已成为心肌再血管化标准的常规方法,冠状动脉搭桥术,是让心脏搏出的血从主动脉经过所架的血管桥,流向因引起狭窄或梗阻的冠状动脉远端而到达缺血的心肌,从而改善心肌的缺血、缺氧状态的治疗方式。目前世界上大多数搭桥手术仍在CPB下进行。其优点是心脏停止跳动,术野静止、无血,便于准确完全地进行冠脉搭桥,操作方便安全。大量事实证明其具有良好的早期及远期效果。CPB技术已比较成熟,但对机体来说,仍是一种不正常状态,可带来一系列病理生理紊乱,如炎性反应、血液破坏、血液稀释、颗粒和异物栓子形成、缺血再灌注损伤,可能加重严重肺、脑、肾患者的病情。近十年来,随着医学发展和技术的进步,开展了通过心脏不停跳和不需要体外循环的方法来完成搭桥手术,即非体外循环心脏跳动下搭桥手术(OPCAB)。这也是心脏稳定装置的不断改进与心脏外科手术完美结合的结果。它使心脏需要搭桥的一小部分保持极小的运动状态,而整个心脏的绝大部分在正常跳动和持续工作为全身供血,减少了心肌再灌注损伤,成功的减少了手术并发症和促进早期康复。非体外循环心脏跳动下搭桥手术拓宽了冠脉搭桥手术的适应证。对于高危病人,尤其是伴有肺、肾、神经系统以及严重左心功能不全的病人更适合于非体外循环心脏跳动下搭桥。这种方法使手术后的恢复过程更平稳顺利。术后发生重要脏器功能衰竭的发生率减少。如今,非停跳冠脉搭桥(OPCABG)虽有取代停跳冠脉搭桥(CABG)的趋势,但其本身始终也存在缺血再灌注损伤的问题。只有充分认识和解决OPCABG中缺血再灌注损伤这一问题,心脏才会得到强有力的保护。Toll样受体是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体,在天然免疫反应中具有重要作用。Toll样受体4(TLR4)不仅是介导脂多糖信号跨膜转导的主要受体,而且也参与了缺血性损伤等非病原微生物性炎症反应。有关TLR4及其介导的信号转导在冠心病中的作用日益引起人们的关注。深入研究TLR4在冠心病中的作用,有可能为进一步揭示冠心病的发病机制并为寻求有效的防治措施提供重要的理论基础。材料与方法：本研究项目首先以SD大鼠建立OPCABG模型,然后获取心肌组织经电镜观察其超微结构变化,同时采用分子生物学方法分析心肌细胞中TLR4与mRNA,HSP60在不同时间段活性表达的变化,以期明确大鼠OPCABG中上述观察指标之间的关系。1动物实验：以SD大鼠为实验对象,由山东大学实验动物研究所提供,其TLR4基因存在点突变,对内毒素天然耐受。30只大鼠,16-18周龄,体重250-320g。共分2个小组,假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)。缺血再灌注组大鼠被钳夹冠脉主干,3分钟后撤去钳夹,以此模仿冠脉搭桥后造成的急性缺血再灌注损伤。每组再分5个时间点,分别为冠脉主干钳夹后0、1、6、12、24h,在每个时间点上处死3只大鼠。在上述时间点,给以腹腔内注射过量的戊巴比妥钠(80mgPkg)处死大鼠,快速低温剪取心肌组织。2心脏TLR4mRNA表达按说明书操作进行PCR反应。3心脏组织热休克蛋白60(HSP60)含量检测应用HSP-AELISA试剂盒检测,具体操作按说明书进行.4心脏组织电镜下观察实验结束时留取大鼠心肌组织,电镜下观察超微结构变化。5统计学处理目的基因电泳条带密度值以灰度@面积、参照物的值表示。所有数据用SPSS软件统计处理,数据均以x±s表示,统计学处理采用t-test。结果：1.应用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测HSP60水平并进行对比分析。结果在假手术组和缺血再灌注组HSP60水平间差别有显著性意义(P＜0.01)；缺血再灌注组HSP60水平明显高于假手术组。2. Sham组心肌组织形态及超微结构改变不明显；IR组心肌损伤较重,缺血心肌恢复血液灌注8h内,其病理学变化未见显著改善。3. Sham组与IR组TLR4蛋白都有阳性表达,IR组TLR4表达增加,且以再灌注1h最明显(19.62±3.84,P(0.01)。4.与Sham组比较,IR组心肌TLR4mRNA表达水平均出现不同程度上调,以再灌注1h达到峰值[(4.03±0.85)×10^-2,P＜0.01],而Sham组各时间点未见明显改变。5.心肌TLR4mRNA表达与HSP呈正相关(r=0.728,P(0.01)。结论：1.心肌Toll样受体4与mRNA表达水平呈正相关表达,TLR4在心肌早期心肌缺血再灌注后的上调和活化表明Toll样受体4在心肌缺血再灌注中可能发挥重要作用。2.热休克蛋白60阳性染色,观察缺血再灌注组,Toll样受体4与蛋白的水平明显增加,而且高峰在1小时后灌注。此外,在缺血再灌注组,Toll样受体4与mRNA水平也上调了。3.TLR4水平与mRNA,HSP,表达积极。心肌Toll样受体4表达在早期心肌缺血再灌注时升高。Toll样受体4激活可能在心肌组织缺血再灌注中发挥重要作用,增加mRNA与HSP的表达。4.心肌缺血再灌注早期,心肌TLR4表达迅速上调,TLR4的激活可能通过促进TNF-Q等炎性因子的产生分泌增多来介导心肌缺血再灌注损伤。5.缺血再灌注组病TLR4 mRNA表达、HSP表达均显著高于假手术组。TLR4可能通过促使炎性因子产生分泌增多来介导脑缺血炎性损伤。