背景与目的目前维生素D缺乏是一个全球性公共卫生问题。大多文献把血清维生素D水平<20 ng/ml (50nmol/L)作为维生素D缺乏的标准,21-29 ng/ml之间作为维生素D不足的标准。据此标准,初步估计全球约有10亿人口处于维生素D缺乏或不足状态。其中既有包括儿童、老年人、妊娠和哺乳期妇女在内的普通人群,也有部分罹患各种慢性疾病的病人。传统研究认为维生素D主要参与钙磷、骨代谢,影响骨骼的生长、发育过程。近期研究发现维生素D受体(VDR)广泛存在于脑、心脏、皮肤、前列腺、乳腺以及免疫细胞、非实质性肝细胞等多种类型细胞中。一些组织和细胞具有酶转换机制,可将循环中的原型维生素D[(25(OH)D3)转换为活性形式(1,25(OH)2D3)。据此推测维生素D的生理作用远远超出我们之前的认识。近几年的研究证实,维生素D与多种病理生理过程相关,如参与炎症反应、调节免疫功能、调节细胞增殖、参与肿瘤发生及发展、参与纤维化发生等,其中在慢性肝病患者中普遍存在的维生素D缺乏的流行病学研究引起学界的关注。近年研究发现,在慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝硬化等多种慢性肝病患者中维生素D水平显著低于正常对照人群。究其原因可能与以下因素有关：患者日光照射时间减少,饮食中维生素D摄入不足,肝细胞受损后影响维生素D的中间代谢等。研究还发现慢性肝病患者维生素D缺乏程度与基础肝病严重程度之间存在相关性：维生素D水平越低,患者肝功能越差,出现肝硬化.并发症的可能性增加,预后也越差。维生素D缺乏与基础肝病之间互为因果：一方面维生素D前体在肝脏内的羟化作用是维生素D代谢过程中重要的中间环节。肝功能障碍时,25-羟化酶活性降低,肝脏合成25(OH)D3减少,同时维生素D的吸收也减少,最终导致机体维生素D水平的降低；另一方面随着慢性肝病患者体内维生素D水平的下降,许多维生素D在肝脏内的正常生理功能受到影响,从而加重肝功能损害,进一步引起体内维生素D水平的下降。二者互为因果并形成恶性循环。目前对慢性肝病与维生素D缺乏的研究主要集中在临床流行病学方面,积累了许多不同病因所致的慢性肝病患者维生素D水平的流行病学研究,以及维生素D水平与临床病情、肝功能、并发症及预后之间的相关性研究。部分细胞水平的研究探讨了维生素D对细胞增殖、凋亡、细胞因子分泌等影响。在维生素D缺乏与肝脏炎症和纤维化之间的研究中,体外实验结果发现维生素D可以调节肝内免疫细胞功能,调节肝星状细胞活性,诱导炎症和纤维化发生。但是目前基于动物模型方面,针对维生素D缺乏对肝脏炎症和纤维化发生发展的研究相对较少。维生素D缺乏对肝脏炎症和纤维化发生发展产生如何的影响以及如何作用于肝内细胞(包括实质性肝细胞和非实质性肝细胞)这些复杂的问题远未阐明。因此,本研究的目的是应用维生素D缺乏饮食及避光环境构建维生素D缺乏小鼠肝脏慢性炎症和早期纤维化模型,并进一步对部分可能的机制进行初步的探讨,希望能对临床上维生素D缺乏对肝脏的影响提供实验依据。研究方法1.维生素D缺乏诱导肝脏慢性炎症和早期纤维化小鼠模型的建立研究对象及处理方式：采用4周龄Balb/c雄性小鼠作为研究对象,根据实验设计将Balb/c小鼠分为3组：正常纯化(Normal)组、维生素D缺乏(Vitamin D deficiency, VDD)组、四氯化碳(carbon tetrachloride, CCL4)组。其中Normal组作为阴性对照,而CCL4组作为阳性对照。3组的具体处理方法分别为：Normal组喂标准纯化饲料、清洁水、清洁级饲养、正常光线环境及昼夜变化；VDD组喂标准纯化维生素D缺乏饲料、清洁水、清洁级饲养、鼠笼置于遮光并透气的纸箱中；CCL4组喂标准纯化饲料、清洁水、清洁级饲养、正常光线环境及昼夜变化。Normal组和VDD组饲养方法不变至实验完成。CCL4组1-4周按上述方式处理,5-9周增加CCL4腹腔注射,lml/100g体重/次,2次/周,共5周,CCL4浓度依次从2%、5%、10%、20%、30%每周递增。每次注射前按照比例将CCL4和矿物油混匀配制。实验期间每天观察小鼠反应、活动、毛色变化并记录。每周定时测定并记录小鼠体重和饲料消耗量。9周时麻醉并处死小鼠,经下腔静脉穿刺取血约300-600μL然后分离血清,置-80℃冻存备用。取部分肝脏组织放入10%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片、行H&E及天狼星红染色,其余肝组织置液氮快速冷冻后在-80℃冰箱冻存备用。观察指标的确定：9周末时测定各组小鼠血清25(OH)D水平,确定VDD组小鼠血清维生素D水平是否符合维生素D缺乏标准；测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)来反映肝细胞损害程度；病理切片进行H&E染色及天狼星红染色,从病理学方面来反映肝脏炎症和纤维化程度；检测参与肝脏炎症和纤维化形成的相关分子的mRNA表达水平,检测的基因包括：CD14、TLR-4, IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-13、HO-1、MCP-1、α-SMA、Coll、 ColⅢ、TGF-β、MMP13、TIMP-1、MMP9;明胶酶谱测定MMP2. MMP9酶的活性变化。通过以上的观察指标测定,一方面证实了本实验中维生素D缺乏的小鼠,在9周时肝脏出现了可以明显观察到的炎症和早期纤维化改变(现象),另一方面从基因水平研究了维生素D影响参与肝脏炎症和纤维化形成的相关基因的表达以及相关酶活性的变化(机制)。2.维生素D缺乏对小鼠肝脏细胞凋亡影响的研究肝细胞损伤甚至死亡是肝脏炎症和肝纤维化改变的基础。凋亡是存在于细胞中的自毁机制,对维持细胞多种功能起重要作用。近期文献显示维生素D对正常肝细胞和肝癌细胞凋亡的影响不同。维生素D通过抑制细胞凋亡途径保护正常肝细胞,而对于肝癌细胞则可促进其凋亡。因此认为维生素D具有潜在的肝癌治疗作用。我们推测维生素D缺乏可能会促进小鼠正常肝细胞凋亡,从而引起肝功能的损害,诱导肝脏炎症和纤维化的发生发展。这一部分实验研究的目的在于探讨维生素D缺乏对小鼠正常肝细胞凋亡的影响及部分可能机制。观察指标包括：肝组织TUNEL染色；肝组织Fas、Fas-L、Caspase3免疫组化染色；Real time-PCR检测Bcl-2、Bcl-XL、Bax、TGF-α、 TGF-β1、Caspase3 mRNA表达。研究结果1.VDD组小鼠在实验中后期出现了皮毛晦涩及脱毛、活动减少表现；VDD组在9周末时测定25(OH)D水平显著低于Normal组；9周时CCL4组和VDD组肝脏肉眼观与Normal组明显有别,ALT、AST水平显著高于Normal组(均P<0.01)；H&E染色示CCL4组炎症和坏死明显,VDD组显示部分肝细胞脂变及坏死,轻、中度炎细胞浸润；CCL4、VDD组Knodell炎症评分显著高于Normal组(均P<0.05)；天狼星红染色示VDD组、CCL4组纤维沉着面积较Normal组增大；胶原定量分析与Normal组均有显著性差异(P<0.05)；明胶酶谱法检测MMP2、MMP9活性,VDD组MMP9活性低于Normal组,而MMP2则高于Normal组；Realtime-PCR检测结果显示VDD组CD14、TLR-4、以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-a表达升高,抑炎因子IL-10、IL-13、HO-1表达降低,趋化因子MCP-1表达升高,α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、 TGF-β、MMP13、TIMP-1表达升高,MMP9表达下降。2.肝组织TUNEL染色结果：Normal组弱于VDD组和CCL4组,棕褐色沉淀物主要分布在胞膜内侧；Normal、 CCL4、VDD组凋亡率分别为28.32±12.26%、47.09±6.31%、42.40±17.69%,其中Normal与CCL4组之间差异有统计学意义(Z=-4.099,P<0.001),而其余组之间无统计学意义(P>0.05); Fas、Fas-L、Caspase3免疫组化染色结果及半定量分析：Fas和Fas-L主要表达在肝细胞和少量淋巴细胞、胆管上皮细胞的胞膜和胞浆内,Caspase3主要表达在肝细胞胞浆内。Fas染色在CCL4、VDD组强于Normal组。Normal、 CCL4、VDD组阳性指数分别为：35.00±1.56%,144.43±55.00%,61.27±9.69%。组间比较发现Normal组与CCL4组之间差异有统计学意义(Z=-2.898,P=0.004<0.01), Normal组与VDD组比较差异有统计学意义(Z=-2.898,P=0.004<0.01),CCL4组与VDD组比较差异有统计学意义(Z=-2.882,P=0.004<0.01)。Fas-L染色在Normal、CCL4、VDD组小鼠肝组织表达程度接近。Normal、CCL4、 VDD组阳性指数分别为：81.67±25.04%、118.91±56.09%、88.49±24.22%,各组间比较无显著性差异(X2=0.751,P=0.687>0.05)。Caspase3染色CCL4、VDD组强于Normal组。Normal、 CCL4、VDD组阳性指数分别为：27.70±3.72%、172.85±33.90%、105.32±52.95%。各组间比较发现Normal组与CCL4组之间差异有统计学意义(Z=-2.898,P=0.004<0.01),formal组与VDD组比较差异有统计学意义(Z=-2.898,P=0.004<0.01), CCL4组与VDD组比较差异有统计学意义(Z=-1.922,P=-0.055>0.017)；Realtime-PCR结果VDD组较Normal组Bcl-2、Bcl-XL、TGF-α的mRNA表达下调,Bax、Caspase3、TGF-β1的mRNA表达上调。研究结论1.成功构建了维生素D缺乏诱发的肝脏慢性炎症和早期纤维化小鼠模型。2.维生素D缺乏可促进Balb/c小鼠相关的部分炎症分子基因表达,同时抑制了部分抑炎因子表达。维生素D缺乏同时促进肝星状细胞的激活,Ⅰ型和Ⅲ型胶原基因表达增加,MMP9活性下降,可能与炎症一起引起肝脏早期纤维化的发生。3.维生素D缺乏可以促进Balb/c小鼠肝细胞凋亡,引起肝功能损害,促进肝脏炎症和早期纤维化的发生。维生素D缺乏对肝细胞凋亡的促进作用弱于CCL4引起者。维生素D缺乏诱导肝细胞凋亡的机制可能与上调Fas、Fas-L、Bax、Caspase3、TGF-β1 的 mRNA表达,下调抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-XL、TGF-α的mRNA表达有关。