论文部分内容阅读
目的:初步研究去泛素化酶11(Ubiquitin-specific peptidase 11,USP11)在放射性肺损伤发生进展过程中的生物学作用及其可能的调控机制。方法:(1)对Usp11基因敲除小鼠进行繁育鉴定,获得实验所需要的基因敲除纯合子Usp11-/-小鼠和正常野生型Usp11+/+小鼠,并追踪统计小鼠的身长体重等生长发育指标;(2)不同基因型小鼠全身照射9Gy,观察急性放射性损伤时小鼠血白细胞以及淋巴细胞的变化;(3)不同基因型小鼠全身照射7.5Gy,观察统计小鼠生存期;(4)将小鼠分为基因敲除的纯合子Usp11-/-组和正常野生型Usp11+/+组,通过右肺局部精准定位照射30Gy,建立放射性肺损伤的模型;(5)分别于照射后不同时间点对造模小鼠进行影像学扫描观察肺部变化;同时收集小鼠左右肺组织,进行病理学HE染色以及纤维化MASSON特染;取照射后不同时间点的小鼠血清用ELISA法检测小鼠血清TGF-β1的含量;同时用Western Blot的方法完成小鼠肺组织纤维化相关蛋白α-SMA的定量;(6)采用组织块法分离提取不同基因型小鼠肺组织的原代细胞,经免疫荧光的方法观察照射后细胞核内γ-H2AX焦点形成的变化;通过流式细胞仪分析原代细胞联合射线后对细胞周期影响;采用TUNEL染色法检测原代细胞照射后的细胞凋亡情况;(7)将放射性肺损伤小鼠的肺组织样本进行高通量蛋白质组学分析,获取不同基因型小鼠在照射前后与对照组相比可能存在的蛋白质组学变化信息,同时将差异表达蛋白进行生物信息学分析了解其主要的细胞定位以及所涉及到的生物学过程和相关信号通路。结果:(1)敲除Usp11基因对小鼠的生长发育并无太大的影响;(2)急性放射性损伤发生后,基因敲除的纯合子小鼠白细胞的下降速度要慢于野生型小鼠,淋巴细胞的恢复速度快于野生型小鼠;(3)基因敲除的纯合子小鼠在受照后存活时间要更久;(4)接受照射后野生型小鼠肺部损伤会更加严重,表现为影像学上更早出现“云雾状”阴影、MASSON染色显示野生型小鼠血管周围沉积的胶原蛋白更多;在照射后不同基因型小鼠血清内的TGF-β1的水平随着时间变化逐渐增多,但是野生型小鼠的增高水平要大于基因敲除的纯合子小鼠;在放射性肺损伤的早期,野生型小鼠肺组织内α-SMA的水平更高;(5)基因敲除的纯合子小鼠肺原代细胞在照射后γ-H2AX焦点形成显著低于野生型肺原代细胞;在照射后6h,基因敲除的纯合子小鼠原代细胞发生了G2/M期的阻滞,而野生型小鼠原代细胞最为明显的变化是其S期显著增多。而这种不同细胞周期之间的差异在照射后12h即恢复正常。在照射后24h,基因敲除的纯合子小鼠原代细胞的凋亡数目要少于野生型小鼠原代细胞凋亡数。而照射后48h,两种细胞的凋亡数目差异不大;(6)接受照射后两种基因型小鼠肺组织内差异表达蛋白有180种,其中22种表达上调,158种表达下调。后续生物信息学分析发现,这些差异表达蛋白主要富集在细胞胞外区域、外泌体、囊泡以及与细胞外膜结合的细胞器等部位,主要参与的几个生物学过程包括催化活性的负调控、器官再生、水解酶活性的负调控、发展过程的调节以及细胞对NO的反应等方面。而其主要参与的排名比较靠前的信号通路是有关于紧密连接、白细胞跨内皮迁移、粘着斑和碳代谢等方面的。除此以外,通过GSEA富集分析得出Usp11基因敲除还涉及TGF-β信号通路、在肿瘤中转录误调节通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路以及P13K-AKT信号通路的改变。结论:在小鼠体内敲除Usp11基因后,使小鼠全身辐射耐受能力有所增强,并且可以减轻小鼠受照后放射性肺损伤的发生发展。而这其中所涉及到的机制可能与其对TGF-β信号通路、在肿瘤中转录误调节通路以及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、P13K-AKT信号通路等的调控作用有关。