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多发性骨髓瘤（MM）是目前难以治愈的恶性血液病，虽经联合化疗、外周血造血干细胞（PBSC）支持下的大剂量化疗等取得一定疗效，但最终都不可避免产生耐药。近年来，出现了针对分子靶点的治疗，如反应停、蛋白酶体抑制剂等，取得一定的成效，但仍迫切需要新的药物。我们试图研究雷公藤内酯醇（TPL）和高三尖杉酯碱（HHT）对MM的作用及其机制，研究分两部分： 第一部分：雷公藤内酯醇通过影响信号传导途径诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡 雷公藤内酯醇（TPL）是从传统中药卫矛科雷公藤属雷公藤中提取的活性成分，临床已经广泛用于自身免疫性疾病：如类风湿性关节炎、肾炎、红斑狼疮等的治疗。近来研究发现雷公藤还具有显著的抗肿瘤作用，但其对多发性骨髓瘤的作用，国内外尚未见报道。 采用MTT比色法检测，结果显示：经10ng／ml TPL处理48h，RPMI8226和U266细胞的增殖明显受抑，与空白对照组相比，差别有统计学意义（p＜0.05）。TPL作用RPMI8226和U266细胞增殖48h的半数抑制浓度(IC50)均为25 ng／ml。进一步研究发现，外源性IL-6不能阻断TPL对RPMI8226细胞的增殖抑制，TPL与常规治疗MM的药物地塞米松（DEX）虽然无协同作用，但与阿霉素（DOX）有协同或相加作用。更有意义的是，TPL也能抑制3例原代MM细胞的增殖，48h的半数抑制浓度(IC50)为20-40ng／ml。TPL对正常单个核细胞的抑制作用相对较弱，48h的半数抑制浓度(IC50)大于100ng／ml。为探讨TPL对MM细胞株抑制作用的机制，我们从细胞凋亡及细胞信号传导途径两个层面作了进一步的研究。浙江大学博士学位论文 为了对细胞凋亡现象进行准确地定性或定量分析，我们采用多种经典、特异而敏感的实验指标，并利用近年来发展起来的流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量、及磷脂酸丝氮酸（PS）转位。结果显示，20.40n留ml作L作用48h，RPMI8226和UZ“细胞均可见典型的ONA梯形条带;20n岁ml TPL作用24h，在流式细胞仪上可检测到亚二倍体峰;进一步采用Annexinv一PI双标记法流式细胞仪分析，结果显示:Rl，MI8226细胞经l。一on留ml TPL作用24h，凋亡细胞百分数分别为15.43%，28.29%，52.肠%，明显高于空白对照组4.8%;U266细胞1040呵ml TPL作用24h，凋亡细胞百分数分别为12.94%，15.93%，54.04%，也明显高于空白对照组7.76%。 为进一步研究探讨TPL诱导细胞凋亡的可能途径，用Western一blot检测TPL对R即18226细胞easpase一8，一9，一3和PARP蛋白的活性变化。结果显示TPL（一0一4Ong/ml）作用细胞12h，可见明显的。asPase一8，一9，一3和PARP蛋白的激活带。 为研究TPL诱导MM细胞凋亡的可能机制及信号传导途径，本研究采用EMSA法分析TPL作用前、后核转录因子NF一KB活性水平。结果显示TPL（10，20，40ng/ml）分别作用多发性骨翻瘤细胞株RPMI8226、U2666h后，NF一KB活性的抑制呈量效依赖性。对RPMI8226细胞，抑制率分别为17.25%.28.130/0.48.13%;对U266细胞，抑制率分别为11.76%，49%，54.3%。由此实验结果推测，TPL对NFKB活性的抑制可能是TPL诱导朋细胞凋亡的原因之一。 不同浓度仰L（10礴ong/ml）处理RPMI8226 24h，用Western blot检测NF一KB的靶基因bC卜xl也以浓度依赖的方式下调。 采用份estern blot法，本研究测定了NF一KB的抑制蛋白卜B。在TPL作用前、后表达水平变化。结果显示， 10一。n创ml TPL作用12h，RpMI8226细胞执B。蛋白水平表达量轻度增加;相反p一1 KB。（磷酸化1 K BQ）蛋白水平表达显著下降。 我们进一步研究了细胞外信号调节激橄ERK)在TPL作用前后的活性变化。Western blot显示，TPL作用RpMI8226细胞12h后，随着TpL浓度（10一40喇ml）的增加，ERK表达水平基本不变，但p一ERK（磷酸化ERK）下调，提示TPL也能下调E以的活性。 骨公微环境对骨健瘤细胞的生存有重要作用，IL一6是众细胞的主要生长因子，IL一6和VEGF与骨艘瘤的进展有密切关系。我们首先用RT一PCR方法检测了TPL处理后U266细胞IL币表达水平的变化，发现long/耐TpL已能显著抑制IL一6砍NA的表达。用百estern blot检测VEGF，发现TPL能下调VEGF的表达。用ELIsA方法进一步研究TPL对U266细胞、BMSC细胞和U266细胞十BMSC细胞作用48h后IL一6和V所F分泌的影响，结果显示，细胞培养上清中IL书和VEGF的水平明显下降。浙江大学博士学位论文 小结:（l）TPL可直接抑制MM细胞株妙MI8226、UZ“细胞和原代MM细胞的生长，并呈浓度依赖性。（2） TPL对MM细胞抑制作用不能被IL一6所阻断，TPL与DOX有协同作用或相加作用。（3）证实在MM细胞株中有NF一KB和MA pEJERK的组成性激活。（4） 1040n留ml TPL处理一定时间后可明显地诱导M劫细胞凋亡，呈浓度依赖性。（5） TPL诱导MM细胞凋亡机理:①可能与其一「调抗凋亡基因be卜心蛋白有关;②csspase书，一9，一3和PARP蛋白的激活;③一定浓度（10碑on留ml）下，TPL可能通过抑制1 KB“降解，抑制MM细胞核转录因子NF一KB活性，从而诱导MM细胞凋亡;④TPL同时还可下调ERK的活性，也有可能是TPL诱导MM细胞的凋亡的机理之一。（6） TPL不但能直接杀伤肿