人参属(Panax)是五加科下的一个小型属,该属植物中几乎所有植物均有悠久的药用历史,其中人参(P.ginsengC.A.Mey.)是人参属中历史最为悠久、用途最为广泛、临床最为常用的传统中药材之一,在国内外均有着十分巨大的市场需求。作为五加科的多年生草本植物,人参在仿野生条件下栽培周期可长达二三十年,野外更是长达数百年,是极其罕见的寿命漫长的草本植物。端粒是位于真核生物染色体末端的由简单重复的DNA序列和端粒结合蛋白组成的一种复合体结构,在高等生物体中,细胞中的端粒常常会随着细胞分裂次数的增多而逐渐磨损,磨损至某一临界值时(Hayflick极限),细胞停止分裂进入衰老阶段,因此端粒被称为“分子时钟”、“生命时钟”。植物中的端粒序列具有维护染色体和遗传稳定性、影响植物的生理病理过程、与植物寿命密切相关等重要作用,是非常值得关注的研究对象,人参中的端粒长度更是与人参的年龄呈线性相关,是人参年龄鉴定的最佳生物标志物。人参中最主要的药理活性成分以及质量评价的最重要指标性成分是人参皂苷,连续种植多年的人参土壤中含有的人参皂苷具有显著的自毒性效应,使得人参出现明显的连作障碍问题,外源添加人参皂苷的实验也表明了人参皂苷对人参种子和幼苗的生长发育具有显著的影响,外源性的人参皂苷对人参自身的生理活动的这种显著的影响提示我们在植物界分布极其狭窄的人参皂苷可能与人参中的端粒长度之间存在一定的生理学联系,从而维持了人参漫长的生命周期。为了验证人参皂苷与人参端粒长度之间存在生理学联系的科学假说,本论文开展了如下工作:1.开发了快速测定人参端粒长度的Q-PCR方法,并通过经典的端粒长度测定的TRF方法对其进行了评价,首次确立了可以用于人参端粒长度高通量测定的方法。首先采用端粒长度测定公认的“金标准”TRF方法对人参主根的端粒长度进行测定,其次开发了 Q-PCR方法对人参主根的相对端粒长度进行测定,并参照已有研究将Q-PCR方法测定结果与TRF方法进行了相关性考察,结果表明两者相关性良好(R2=0.7577),所建立PCR方法可用于人参中端粒长度的高通量快速测定。2.考察了外源性人参皂苷对人参悬浮细胞端粒长度的影响,结果表明某些二醇型人参皂苷可以使端粒长度缩短,而某些三醇型人参皂苷可以使端粒长度延长,首次确立了外源性人参皂苷与人参端粒长度存在密切的生理学联系,首次提出了二醇型和三醇型的某些人参皂苷在人参体内的生理功能可能具有拮抗性。采用外源添加的方法,向人参悬浮细胞的培养基中加入不同浓度的六种人参皂苷GS1-GS6及两种植物激素茉莉酸甲酯和油菜素内酯,分别于培养一天及七天后收集人参悬浮细胞,采用Q-PCR方法对不同处理后的人参悬浮细胞中的端粒长度进行测定,结果表明培养基中加入二醇型人参皂苷GS1、GS3一天和七天均可以使人参悬浮细胞的端粒显著缩短,培养基中加入三醇型人参皂苷GS2一天和七天,加入GS5七天,均可使人参悬浮细胞的端粒显著延长。3.选取代表性的二醇型及三醇型人参皂苷处理的悬浮细胞,对其转录水平的差异进行了分析,获得了大量有注释的差异表达基因,为人参皂苷的多种潜在生理功能研究提供了基础数据。选取对照组及50μM的MJ、GS1、GS2处理一天后的三份生物学重复样品,进行转录组学研究。结果表明,MJ作为植物激素,对人参悬浮细胞的转录情况影响最大,与三种处理对人参悬浮细胞端粒长度的影响结果一致。KEGG数据库的注释分析表明,MJ处理后植物激素信号转导(plant hormone signal transduction)、淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)两条通路差异基因较多,人参皂苷GS1、GS2处理后内质网中的蛋白质处理(protein processing in endoplasmic reticulum)、植物-病原体互作(plant-pathogen interaction)两条通路差异基因较多,表明这两种处理与MJ处理不同,并非通过激素信号转导途径而是通过病原体途径对人参悬浮细胞产生影响的。4.建立了人参的再生体系及遗传转化体系,并采用人参皂苷生物合成关键酶基因的过表达及干扰,首次对内源性人参皂苷与人参端粒长度的生理学联系进行了探讨。采用多种来源的人参外植体暗培养诱导人参愈伤组织,再将其转入分化培养基中光培养获得丛生芽,将丛生芽转入生根培养基中,光培养即可获得生根的人参再生苗。以人参主根中的RNA反转录的cDNA为模板克隆了人参皂苷生物合成关键酶基因,利用Gateway克隆技术构建了相应的表达载体,采用冻融法将获得的载体转化到根癌农杆菌EHA105、发根农杆菌C58C1中,并采用叶盘法对人参进行侵染。将获得的载体包裹至金粉表面并用基因枪轰击直接将微弹导入人参愈伤组织中,通过农杆菌侵染法、基因枪法对人参遗传转化体系的构建进行了探索。