四川西部横断山脉地区大型真菌资源调查利用及灰褐纹口蘑与鸡枞菌多糖的结构鉴定、活性研究

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四川西部横断山脉地区具有独特的地形地貌及生态环境。本文结合形态学鉴定法和分子生物学,对四川西部横断山脉地区大型真菌资源多样性进行了系统调查。同时以灰褐纹口蘑(Tricholoma sinoportentosum)及鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)为例,探索大型真菌资源的开发及利用价值,为大型真菌资源的合理利用及四川西部横断山脉地区生态系统的维护提供理论依据。研究结果如下:(1)本文对四川西部横断山脉地区的大型真菌标本进行调查统计,结果显示共鉴定出大型真菌46种,隶属于1门4纲6目14科20属。优势科(≥5种)包含白蘑科(Tricholomataceae)、丝膜菌科(Cortinariaceae)和红菇科(Russulaceae)在内的共3科31种,占总科数的21.43%,占总种数的67.39%。优势属(≥5种)包括口蘑属(Tricholoma)和丝膜菌属(Cortinarius)在内的共2属15种,占总属数的10.00%,占总种数的32.61%。(2)本文选用具有代表性的白蘑科真菌(灰褐纹口蘑和鸡枞菌)作为研究对象,采用热水浸提法、乙醇醇沉法、DEAE-52纤维素柱层析法及浓缩、透析、冻干等操作从子实体中得到了两种均一多糖,即灰褐纹口蘑多糖(TS-P)和鸡枞菌多糖(TA-P),分子量分别为22 935 Da和26 492 Da,多糖的得率分别为2.52%和3.19%。(3)结合高效凝胶渗透色谱(High-performance gel permeation chromatography,HPGPC)、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)、高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)、气相色谱与质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)和核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)的结果对灰褐纹口蘑多糖(TS-P)和鸡枞菌多糖(TA-P)的化学结构进行鉴定。结果显示,TS-P由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,比例为1:1:3:2,其一级结构是以(1→4)-Arap、(1→4,6)-D-Manp和两个(1→6)-Galp为主链,在甘露糖4-O上连接两个(1→4)-Glcp和一个→2)-α-D-Glcp端基。TA-P由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,比例为2:4:8,其一级结构是以两个(1→4)-β-L-Arap、一个(1→4)-Glcp、三个(1→2,6)-Galp和五个(1→6)-Galp为主链,从半乳糖2-O延伸支链连接一个→1)-Glcp末端单糖。经Sci Finder查新,显示TS-P和TA-P结构新颖。(4)采用CCK-8法探究灰褐纹口蘑多糖(TS-P)和鸡枞菌多糖(TA-P)对三种细胞增殖的影响。结果表明,在一定浓度范围内,TS-P和TA-P在体外具有B细胞、T细胞和巨噬细胞的增殖活性。当TS-P的终浓度为2.5μg/m L时,对B细胞、T细胞和巨噬细胞的增殖影响最大,增殖率分别为40.47%、59.27%和69.33%。当TA-P的终浓度为5μg/m L时,对B细胞的增殖影响最大,增殖率为29.55%,当TA-P的终浓度为2.5μg/m L时,对T细胞和巨噬细胞的增殖影响最大,增殖率分别为43.90%和34.64%。综上,TS-P的细胞增殖活性优于TA-P。(5)采用流式细胞术探究灰褐纹口蘑多糖(TS-P)和鸡枞菌多糖(TA-P)对三种细胞周期的影响。结果表明,对于B细胞和巨噬细胞,TS-P和TA-P均是通过影响G0/G1期的细胞数量占比进而影响细胞周期。而对于T细胞,TS-P和TA-P对其细胞周期的影响不同,TS-P是通过影响G2/M期,即影响细胞的有丝分裂,TA-P主要是通过影响G0/G1期的细胞数量占比进而影响细胞周期。因此TS-P和TA-P可以作为有丝分裂原促进细胞分裂,进而促进细胞增殖。(6)采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法探究TS-P和TA-P对三种细胞分泌细胞因子的影响。B细胞ELISA结果表明,2.5μg/m L的TS-P能极显著促进B细胞分泌Ig A、Ig G和Ig D(P<0.01),分泌量分别为596.62μg/m L、22.57 mg/m L、483.82μg/m L;而5μg/m L的TA-P能极显著促进B细胞分泌Ig A和Ig G(P<0.01),分泌量分别为602.50μg/m L、22.64 mg/m L。T细胞ELISA结果表明,2.5μg/m L的TS-P和2.5μg/m L的TA-P均能极显著促进T细胞分泌TNF-α(P<0.01),分泌量分别为33.74 pg/m L和50.55 pg/m L。巨噬细胞ELISA结果表明,2.5μg/m L的TS-P和2.5μg/m L的TA-P都不能促进巨噬细胞分泌IL-1β;但均能促进巨噬细胞分泌TNF-α,分泌量分别为694.09 pg/m L和336.02 pg/m L,且TS-P组与空白组相比差异极显著(P<0.01),TA-P组与空白组相比差异显著(P<0.05)。综上所述,本文首先对四川西部横断山脉地区大型真菌的资源状况进行了系统研究。其次以灰褐纹口蘑和鸡枞菌为例,解析了灰褐纹口蘑多糖和鸡枞菌多糖的化学结构,及探究了两种均一多糖的构效关系,为大型真菌资源的研究开发、资源微生物多样性保护与利用及维持四川西部横断山脉地区生态系统的平衡提供理论依据。
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