放射性脑损伤(radiation injuries，brain；RIB)是头颈部恶性肿瘤放射治疗后常见的中枢神经系统并发症，原发肿瘤在得到放射治疗的同时，RIB的出现成为限制脑部放射剂量、影响疗效和降低病人生存质量的重要因素。目前临床对RIB治疗以抗氧化、脱水剂、激素及对症支持治疗为主，无法从根本上逆转其病情变化，所以寻找有效的治疗方法十分必要。本课题组前期实验曾尝试碱性成纤维生长因子(bFGF)转染C17.2神经干细胞移植治疗，发现对RIB有一定的治疗作用。引起RIB特别是晚期RIB的病理机制尚未完全阐明，近年来对放射性脑病发生机制的研究主要集中在血管内皮细胞损伤和血脑屏障破坏方面。血管壁各成分中以内皮细胞对放射线最敏感。有研究显示，单次大剂量照射后24小时就可见内皮细胞凋亡损失，这种损失可以持续52周，最后导致40％～65％的血管内皮损失。大量的内皮细胞损失导致微血管床破坏，伴随微血管床破坏是微循环的明显障碍，并导致脑的供血供氧减少，最终出现脑细胞坏死、脱髓鞘等病理改变。特别是侧支循环不发达的白质，可出现片状白质坏死。所以微血管内皮细胞可能是RIB的最主要效应细胞。由此可见，寻找以脑微血管内皮细胞再生为治疗靶点的方法可能是治疗RIB的最有效手段。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种最为有效的促血管生成因子，已有很多研究证实往缺血部位导入VEGF可以显著诱导血管新生。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是有多项分化潜能的成体干细胞，来源广泛，易于分离和培养，也是基因治疗的一种合适的工具细胞。基因联合细胞移植治疗已经在血管再生工程学上得到广泛应用。本研究的目的：构建VEGF基因重组腺病毒(为便于在后续实验中区别转基因VEGF和宿主内源性的VEGF，我们在VEGF目的片断上添加一个HA标签)，转染MSC，植入放射后大鼠脑微血管损伤区，观察其分泌VEGF，是否可以促进该部位血管新生，改善脑功能。本实验内容分为三部分： 1、Ad—VEGF—HA重组腺病毒的构建和鉴定； 2、Ad—VEGF—HA重组腺病毒转染MSC和VEGF的表达及其分泌； 3、VEGF联合MSC移植治疗促进放射性脑微血管内皮的新生。 第1章 Ad—VEGF—HA重组腺病毒的构建和鉴定 研究目的： 构建Ad—VEGF—HA重组腺病毒并进行鉴定。 研究方法： pcDNA3.0-VEGF—HA(质粒为山东大学张刚博士馈赠)测序后行EcorⅠ和KpnⅠ双酶切回收，与用同样酶切回收的pAdtrack—CMV质粒连接为pAdtrack—CMV—VEGF—HA，连接质粒用Pme1酶切，回收目的片断后与pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5183、DH5a，鉴定后用Pac1酶切回收转染HEK293A细胞进行包装。约10天后细胞病变比较完全和细胞内绿色荧光变弱时，回收、反复冻融HEK293A细胞，离心回收上清行酶切、电泳鉴定和病毒滴度测定。 结果： 1.鉴定pAdtrack—CMV—VEGF—HA穿梭质粒、pAdeasy—CMV—VEGF—HA整合质粒和重组腺病毒基因组内含VEGF—HA基因。 2.HEK293A细胞内荧光显示病毒包装成功。病毒滴度约为T≈1×1011GTU/mL。 结论： 成功构建Ad—VEGF—HA重组腺病毒，为下一步转染MSC做好准备。 第2章 Ad—VEGF—HA重组腺病毒转染MSC和VEGF的表达及其分泌 研究目的： 将Ad—VEGF—HA重组腺病毒转染入MSC内，使MSC稳定表达并分泌VEGF。 研究方法： 全骨髓法(直接培养法)获取SD大鼠骨髓间充质干细胞。MSC传两代后将细胞接种于25c㎡培养瓶中，培养至90％融合时进行转染。添加Ad—VEGF—HA重组腺病毒0.5ml(MOI=50)，转染3小时后更换培养液，48小时后观察转化效率。免疫组化和方法测定VEGF表达。ELISA法检测重组MSC细胞分泌的VEGF。 结果： 1.Ad—VEGF—HA重组腺病毒感染MSC后6h(MOI=50)，部分细胞已经有荧光显示，随着转染时间的延长，荧光越来越强。转化率可达80％。 2.抗HA免疫组化染色示重组MSC细胞胞浆中有褐色颗粒，表明其有VEGF—HA表达。 3.随着重组MSC细胞的克隆性增殖，其分泌的VEGF也逐渐增多。经ELISA法测定，一周后培养上清中的VEGF分泌量达平台期，第8天时达2471ng/mL。据此，我们选择培养一周的重组MSC细胞进行移植。 结论： 成功将Ad—VEGF—HA重组腺病毒转染入MSC内，使MSC稳定表达并分泌VEGF。为以后的移植治疗做准备。 第3章 VEGF修饰MSC移植治疗促进放射性脑微血管内皮的新生 研究目的： 建立大鼠RIB模型，将VEGF转基因MSC移植入大鼠脑微血管损伤区，观察移植区内皮细胞密度变化，外源性VEGF分泌以及模型大鼠的行为学改变。 研究方法： SD大鼠全脑分割照射45Gy，每次5Gy，共9次，3周内完成制造RIB模型。A组为单纯照射组，B组为转基因干细胞移植组，C组为注射单纯MSC移植组，D组注射同体积生理盐水组，E组为未照射组。B组动物在最后一次照射完成后第7天，在立体定位仪下，微量注射器向右侧内囊区域注入5μL(1×105个)转染VEGF的MSC细胞悬液。C组只注射5μL(1×105个)MSC细胞。治疗后各时间点行冰冻切片观察治疗区域血管内皮细胞标记物Ⅷ因子免疫组化荧光标记和GFP示踪蛋白。5个随机高倍视野下Ⅷ因子阳性细胞数代表微血管密度(40×，0.13mm2)。Western blotting方法检测治疗部位VEGF—HA融合蛋白的表达情况。照射后各时间点观察病理切片，EB法测血脑屏障改变，Morris水迷宫法检测大鼠学习记忆能力。 结果： 1.移植后2周，B组治疗部位组织病理切片在荧光显微镜下可见大量GFP显示，3周后明显减少。 2.移植后2周的，B组注射部位区组织Western blotting检测VEGF—HA融合蛋白的表达情况，结果发现注射部位有较多VEGF—HA表达。 3.血管内皮细胞标记物Ⅷ因子免疫组化显示，照射后1个月，与未照射组相比，内囊区内皮细胞密度已经出现下降(P<0.01)，照射后3个月细胞密度进一步下降。照射后1个月和3个月B组较A组内皮细胞密度增加(P<0.01)，C组内皮细胞密度较A组有增加(P<0.05)，但少于B组(P<0.05)。 4.组织病理学显示各组大鼠治疗部位并未出现出血和白质坏死等改变。 5.受照后各组EB含量在照射后2周未见升高，照射后1个月开始，EB含量开始增加(P<0.05)；3个月较1个月时显著增加。B组治疗组的EB含量较A组单纯照射组明显减少(P<0.01)。 6.学习记忆能力检测：照射后3个月和4个月，照射组大鼠学习记忆能力出现进行性下降，B组学习记忆能力显著改善(P<0.01)。C组较A组学习记忆能力亦有改善，但改善幅度小于B组(P<0.01)。 结论： VEGF联合MSC移植治疗对放射性脑损伤具有治疗作用，这种作用在于在损伤局部提供持续表达和足够浓度的外源性VEGF，促进损伤区域微血管和内皮细胞的再生，保证白质区的供血，减轻放射后脑组织损伤。