论文部分内容阅读
植物在生长过程中,多种外界因素和内部因素能引起细胞内DNA的损伤。这些损伤能否被修复以及所采用的修复方式将决定细胞的存亡与变异。此外,DNA损伤能作为一种信号影响植物的生长发育。因此,建立一套直观、高效的DNA损伤检测系统,有利于研究环境对DNA的损伤诱变作用、信号转导途径、相关修复蛋白的功能鉴定和植物的进化与适应等问题。
本文利用已获得的转重组载体株系,研究了水稻基因组DNA损伤后通过同源重组(homologous recombination,HR)修复的特点、影响水稻DNA同源重组效率的因素如转基因拷贝数、插入位点数、关键HR修复蛋白基因的表达模式、DNA损伤胁迫条件、植物生长调节剂和异源RecQ/RAD54基因的表达等。具体结果如下:
1、系统研究了水稻染色体内同源重组发生的特点。发现水稻各组织中都有同源重组发生,且同源重组发生的频率具有组织特异性,在水稻中愈伤、根和叶(三叶期)的HR发生频率高低顺序为:愈伤组织>根>叶。其中,愈伤组织的HR频率是根的1.7～19.6倍(株系间差异),是叶的22.2～500.3倍(株系间差异),这些差异反映了它们的基因组稳定性不同。组织切片观察发现胚性愈伤和非胚性愈伤中都有重组发生,但胚性细胞的重组率较高,约为70％；根中的重组主要集中在皮层和内皮层,占80％以上,很少发生在维管束。DAB染色和TUNEL检测发现代谢活性高和DSB发生较频繁的细胞与较高的重组频率相关。
2、重组载体整合进水稻基因组的拷贝数(位点数)、插入位点的周边序列特点及甲基化修饰均会影响HR频率。在愈伤、根和叶(三叶期)中发现插入拷贝数(位点数)越多,HR频率越高。通过分析获得的21个株系插入位置的侧翼序列,发现仅8个株系的插入位置在基因内部,多数插入位置的序列为基因的间隔区。发现这些整合位点两侧序列特点与HR频率存在密切关系,该侧翼序列在基因组内部含重复区域即可促进HR频率,且重复区域越长,HR频率相对就越高；整合位点甲基化还会导致HR频率降低。
3、通过生物信息学分析发现水稻基因组中含8个RAD51类蛋白家族成员(HR修复关键酶),包括2个DMCⅠ(DMCⅠ a和DMCⅠ b)、2个RAD51(RAD51a和RAD51b)、RAD51B、RAD51C、RAD51D和XRCC3；2个Ku70蛋白(NHEJ修复关键酶),1个为完整蛋白,另1个是N-端片段。与拟南芥相比,对应蛋白成员之间具有较高的同源性。通过RT-PCR方法分析RAD51类和Ku70蛋白基因的时空表达模式,发现2个DMCⅠ基因表达模式比较接近,在各个组织中均有表达,且都在颖壳和花药中表达量最高,而在愈伤、根和旗叶中的表达较低,在幼叶中的表达最低。两个RAD51基因表达模式不同,RAD51α在愈伤、旗叶和花药中的表达较高,根和颖壳较弱,在幼叶中表达最弱；而RAD51b在愈伤中表达最强,在花药和根中有表达,但较弱。RAD51B和RAD51C表达模式相似,除在愈伤中的表达偏低外,在其它各组织中表达差异不大。XRcc3的表达模式比较特殊,除在根中表达量较高以外,在别的组织中表达都很低。RAD51D在愈伤、旗叶和花药中表达较高,而在幼叶和根中表达较低。Ku70在个组织中都有表达,只是在花药和颖壳中表达较弱。
4、用不同DNA损伤胁迫(C060-γ射线、重金属和干旱)处理同源重组株系发现这些处理都能不同程度地提高HR频率,说明该系统可以实时检测外界环境对植物DNA损伤及同源重组的影响。
5、外源激素(GA3、6-BA和2,4-D)处理对同源重组频率有明显的促进影响,尤其GA3作用最明显。GA3可分别提高根和叶中同源重组率约5倍,而6-BA只提高了约2.7倍。同源RT-PCR分析GA3对修复关键酶的影响,发现DMCⅠ和RAD51D基因表达模式变化不大,说明不受GA3影响；RAD51α、RAD51b、RAD51B、RAD51C、XRcc3和Ku70的表达在不同程度上受GA3的诱导,尤其对根部RAD51C表达有明显的促进作用；RAD51α比RAD51b受GA3的调控更明显,在根中随着GA3浓度的增加RAD51α表达量明显增加；在根和叶中RAD51B随着GA3浓度的增加出现先升后降的趋势。此外还发现如果缩短GA3处理的时间(24h),HR频率仍会增加。
6、为了检测异源蛋白对水稻HR的影响,本文通过田间杂交获得了同源重组株系和酵母RAD54和大肠杆菌RecQ超表达转基因株系的杂交后代,发现表达异源重组酶对水稻HR频率有促进作用。在对杂交后代进行分子检测时,发现后代与亲本之间存在较大的差异,有的母本的条带消失,有的父本的条带增大,说明在杂交过程或后代生长期基因组内有重组现象发生,这将为深入研究水稻同源重组机理提供较好的材料。