目的:CYP119酶具有选择性催化芳香族烯烃环氧化的能力,环氧化物是制备各种药物、香料及合成中的重要中间体。前人对CYP119酶活性中心两个连续保守苏氨酸残基的作用进行了详细研究,而对其另外一个215位保守苏氨酸作用未见研究。CYP119酶晶体结构显示,153位苯丙氨酸正处于底物进入的通道部位,因此该位点氨基酸突变后,能否改变该酶的催化效率?本研究构建了215位和153位的一系列突变体,试图明确CYP119酶中保守215位苏氨酸和153位苯丙氨酸在催化苯乙烯类底物环氧化反应的作用。方法:通过理性设计、定点突变等技术手段,获得CYP119酶突变体T215G、T215V、F153A、F153V、T213M/F153A,考察了CYP119酶215位突变体的热稳定性;端基双键的苯乙烯类似物和非端基双键的?-甲基苯乙烯类似物环氧化反应的转化率和对映选择性。结合分子动力学、分子对接等方法,预测153位突变体在催化反应中的作用。通过构建153位突变体,考察其对苯乙烯和顺式-β-甲基苯乙烯的催化能力。结果:CYP119酶突变体T215G和T215V催化端基双键类底物效果与亲本酶类似,而催化非端基双键类底物在转化率和对映选择性上都具有一定变化。突变体T215G催化苯乙烯环氧化反应的转化率高达99.6%。突变体T215G能一定程度提高催化顺式-?-甲基苯乙烯环氧化反应的对映选择性和转化率。突变体T215V催化顺式-?-甲基苯乙烯类底物,环氧化反应对映选择性远低于亲本酶和突变体T215G。突变体F153A、F153V催化苯乙烯转化率和对映选择性与亲本酶、突变体T215G、T215V类似。突变体F153A、F153V催化顺式-β-甲基苯乙烯的转化率和对映选择性高于亲本酶,略低于突变体T215G,而双突变体T213M/F153A转化率下降至13.61%,对映选择性却高达92.4%。分子对接数据显示,突变体F153A催化底物苯乙烯和顺式-β-甲基苯乙烯的效率最高,F153V较亲本酶催化效率也有所提高,而双突变体T213M/F153A催化效率较亲本酶有较大程度下降。结论:215位苏氨酸的氢键效应和侧链氨基酸大小对CYP119酶催化特定底物的环氧化反应具有一定影响。153位侧链氨基酸的大小对底物进入活性中心有重要影响。