大鼠增殖抑制基因过表达对C6胶质瘤细胞侵袭的抑制作用及其机制的研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wuzhi1979
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目的研究大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)过表达对C6胶质瘤细胞侵袭的影响,并研究其可能的调节机制。方法:用携带r H S G基因序列的重组腺病毒Adv-rHSG-GFP感染C6胶质瘤细胞,同时设置Adv-GFP感染的阴性对照组以及仅PBS处理的空白对照组。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中rHSG的表达变化。然后,采用细胞划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别检测rHSG过表达对C6胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响,细胞免疫荧光法和细胞黏附实验分别分析rHSG过表达后C6细胞骨架形成和黏附能力的变化,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)测定各组细胞中Rho/Rock信号通路关键分子Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,RhoA)、Ras相关的C3肉毒底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)、细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1,Rock1)和Rock2的表达水平。。结果1、Adv--GFP、Adv-rHSG-GFP分别感染C6胶质瘤细胞48 h、72 h后,利用RT-PCR及Western Blot检测发现:与Adv-GFP组及PBS组相比,Adv-rHSG-GFP组中C6胶质瘤细胞rHSG的mRNA、蛋白表达水平均明显升高(P值均<0.01);Adv-GFP组与PBS组相比,两组之间mrna、蛋白均无明显差异(p>0.05)。2、划痕愈合实验发现:在划痕30h后,adv-rhsg-gfp组分别与adv-gfp组及pbs组相比,c6胶质瘤细胞的划痕愈合率明显下降(p值均<0.01);adv-gfp组与pbs组相比,c6胶质瘤细胞在两组之间的划痕愈合率无明显差异(p>0.05)。3、transwell实验发现:c6胶质瘤细胞在transwell上室培养24h后,adv-rhsg-gfp组分别与adv-gfp组及pbs组相比,迁移、侵袭至下室的细胞数均明显减少(p值均<0.01)。adv-gfp组与pbs组相比,两组迁移、侵袭的细胞数之间均无明显差异(p>0.05)。4、细胞黏附实验发现:在黏附不同时间(30、60、90和120min),与adv-gfp组及pbs组相比,c6胶质瘤细胞在adv-rhsg-gfp组的黏附细胞数均明显减少(p值均<0.05),且随着时间的延长,差异逐渐缩小。adv-gfp组与pbs组相比,两组之间黏附细胞数均无明显差异(p>0.05)。5、细胞免疫荧光实验发现:重组腺病毒adv-rhsg-gfp感染48h后,adv-gfp组与pbs组的c6胶质瘤细胞形态未发生明显变化,多呈长梭形或星形,伸出较多轴突,呈线状伪足,伪足多向两端伸展且成轴向排列;而adv-rhsg-gfp组的c6胶质瘤细胞骨架发生明显调整,丝状伪足缩短,部分成片状且排列杂乱。6、实时荧光定量pcr及蛋白质印记实验发现:重组腺病毒adv-rhsg-gfp感染48h和72h后,与adv-gfp组及pbs组相比,adv-rhsg-gfp组c6胶质瘤细胞rho/rock信号通路中关键分子rhoa、rac1、cdc42、rock1和rock2的mrna及蛋白表达水平均明显降低(p值均<0.05);adv-gfp组与pbs组相比,两组之间各分子mrna及蛋白表达均无明显差异(p>0.05)。结论1、病毒感染成功,重组腺病毒adv-rhsg-gfp感染48h和72h时,rhsg在c6胶质瘤细胞中成过表达状态。2、当rhsg在c6胶质瘤细胞中表达增高时,细胞的迁移、侵袭、黏附能力均受到明显抑制。3、rHSG过表达抑制C6胶质瘤细胞的骨架形成,促使细胞丝状伪足缩短且重新排列。4、rHSG过表达促使C6胶质瘤细胞中Rho/rock信号通路关键分子mRNA及蛋白表达水平降低,说明rHSG可能是通过阻碍Rho/rock信号通路抑制C6胶质瘤细胞的侵袭。
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