目的：构建免疫豁免分子HLA-G和FasL的慢病毒表达载体，经过293T细胞包装后感染人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hES)，筛选出能稳定表达HLA-G和FasL的hES细胞阳性克隆，分别建立能够稳定地构成性表达HLA-G、FasL和HLA-G-FasL的hES细胞系，为进一步研究这些细胞系的生物学特性，并最终建立免疫豁免的人类组织工程种子细胞奠定基础。　　 方法：⑴HLA-G慢病毒表达载体的构建:从正常孕妇剖宫产后胎盘提取总RNA，用逆转录酶反转录成为cDNA，设计对应引物PCR扩增出HLA-G产物并回收;将目的基因片段与带有EGFP荧光标记和新霉素筛选标记的EX-NEG-Lv183空白载体连接为重组HLA-G慢病毒表达载体EX-HLA-G-Lv183并测序。⑵FasL慢病毒表达载体的构建:设计引物从EX-L0009-M02载体上分离出FasL片段并进行PCR扩增，将回收的目的片段与带有mcherry荧光标记和嘌呤霉素筛选标记的的EX-NEG-Lv111空白载体连接为重组FasL慢病毒表达载体EX-FasL-Lv111并测序。⑶重组慢病毒表达载体的包装:将上述构建的两种表达载体分别与HIVpacking mix包装质粒按1∶1稀释于Opti-MEM培养液中，并与同样稀释于Opti-MEM中的2.5倍含量的Lipofectamine2000脂质体混合后转染293T细胞6小时，换液后48小时观察荧光判断包装效率并提取上清液测定滴度。⑷hES的扩增:人胚胎干细胞(hES)接种于经丝裂霉素处理的饲养层MEF上，在含20％ knockout SR血清，78％DMEM/F12培养液，1％NEAA，1％L-谷氨酰胺以及0.1％β-巯基乙醇和BFGF的培养液中培养，每天换液一次，每3-4天按1∶2比例传代扩增一次。⑸HLA-G/FasL慢病毒感染hES细胞:将病毒液和溴化季铵阳离子(Polybrene)加入到无饲养层条件下培养的hES中培养2小时后补加同体积病毒液，2小时后离心hES2-3次后加到饲养层上常规培养。48小时后观察荧光表达。　　 结果：①经过电泳及测序鉴定成功构建了含有EGFP荧光标记和新霉素筛选标记的重组HLA-G慢病毒表达载体EX-HLA-G-Lv183。②经过电泳及测序鉴定成功构建了含有mcherry荧光标记和嘌呤霉素筛选标记的重组FasL慢病毒表达载体EX-FasL-Lv111。③包装载体过程中摸索发现在载体与转染试剂比例为1∶2.5且转染时间为6小时的情况下，表达载体包装效率最高。在此条件下包装质粒并提取病毒上清液，用孔稀释法测定两种载体包装后的病毒滴度分别为1.0×109TU/ml和5.3×108TU/ml，具备感染目的细胞的条件。④MEF饲养层细胞的制备:将取自孕13.5天的小鼠胚胎的胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）进行传代培养至2-3代，当细胞汇合度到达80％时用浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理2小时可明显抑制MEF的分裂，形成利于hES细胞生长的饲养层细胞。⑤hES细胞的培养:在含有饲养层细胞的条件下每天换液可保证绝大多数细胞在4-5天内不断生长且不发生分化。在无饲养层条件下，hES细胞在Matrigel处理过的细胞培养板上可贴壁生长至细胞汇合度到达40％。⑥分别用HLA-G，FasL慢病毒液感染hES细胞，感染48h后在荧光显微镜下可观察到带有相应荧光标记的阳性细胞。　　 结论：⑴本实验使用总RNA提取和反转录PCR的方法可以从人胎盘组织中扩增出HLA-G目的基因片段，并成功构建了HLA-G重组慢病毒载体EX-HLA-G-Lv183。⑵本实验使用PCR方法可以从含有目的基因片段的哺乳动物真核表达载体中扩增出FasL目的基因片段，并成功构建了FasL重组慢病毒载体EX-FasL-Lv111。⑶本实验摸索出在慢病毒载体与转染试剂Lipofactamine2000比例为1∶2.5且转染时间为6小时的情况下，包装效率最高且可以收集获得较高的病毒滴度。⑷hES细胞在Matrigel处理过的培养板上可以贴壁生长，虽然比在相同培养液条件下饲养层细胞上的生长状态要差，但仍可以进行短时间的培养与扩增。⑸利用本实验所制得的含有HLA-G和FasL慢病毒质粒的病毒液均可以成功感染hES细胞，并获得含有HLA-G和FasL目的基因片段的hES细胞。