莫诺苷对大鼠损伤脊髓保护作用及其机制

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目的:观察莫诺苷对脊髓损伤大鼠的治疗效果,证实莫诺苷对脊髓损伤的神经保护作用;探讨莫诺苷对脊髓损伤保护作用的机理,为将来莫诺苷应用于脊髓损伤等神经退行性疾病的治疗提供理论基础和实验依据。方法:(1)选取体重为220g左右成年雌性SD大鼠128只,采用NYU法制备SD大鼠脊髓损伤模型。(2)采用空旷场地运动功能评分(basso beattie bresnahan Score,BBB评分)系统评估SD大鼠在SCI后1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w时间点的运动功能。(3)脊髓损伤后6w使用4%PFA灌注取材,制备连续冰冻切片,采用苏木素-伊红染色(HE)观察损伤脊髓组织的面积;采用快蓝(LFB)染色观察损伤脊髓组织的髓鞘保留情况。(4)0.01M浓度的PBS灌注用以Western Blot法检测蛋白,4%PFA(0.01M,PBS)灌注用以免疫荧光学检测和化学染色,采用Western Blot法检测SCI后1d、3d、1w、2w时间点Caspase-3的表达变化;采用尼氏染色(Nissal Staining)观察SCI后6W脊髓前角运动神经元的数量;采用免疫荧光双染色法检测SCI后1W和2W脊髓组织少突胶质细胞(CNP)和神经元细胞(NeuN)的数量和凋亡情况。(5)在脊髓损伤后不同时间点心脏灌注取材,0.01M浓度的PBS灌注用以氧化应激产物浓度检测,4%PFA(0.01M,PBS)灌注用以免疫荧光学检测,取材部位和长度均为脊髓损伤中心前后各0.5cm。(6)SCI后1d、3d、1w、2w时间点PBS取材标本制备脊髓组织匀浆,采用过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)试剂盒检测脊髓组织中H2O2和MDA的含量;采用Western Blot法检测脊髓组织3-硝基酪氨酸(3-NT)含量;采用ELISA法检测脊髓组织中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)含量。(7)制备脊髓组织匀浆,采用过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测SCI后1d、3d、1w、2w时间点脊髓组织CAT、GSH-PX、SOD活性。结果:(1)成功制备符合试验要求的SD大鼠脊髓撞击伤模型。(2)行为学BBB评分结果显示:莫诺苷给药组SD大鼠的双后肢运动功能的恢复在SCI后3w、4w、5w和6w评分均高于对照组(P<0.05)。(3)HE染色统计结果显示:与对照组相比,莫诺苷给药组大鼠脊髓损伤面积在损伤中心及其前后1mm和2mm处降低(P<0.05)。(4)LFB染色结果显示:与对照组相比,在损伤中心及其前后1mm和2mm莫诺苷给药组髓鞘保留比例升高(P<0.05)。(5)WB检测发现,莫诺苷给药组大鼠损伤脊髓组织中Caspase-3蛋白的含量在SCI后3d、1w、2w时间点均明显低于对照组;Nissal染色统计结果显示:与对照组相比,在距离损伤中心3mm和4mm处,莫诺苷给药组前角运动神经元数量明显升高,且具有统计学差异(P<0.05);免疫荧光NeuN与Caspase-3双染结果显示:脊髓损伤后1w和2w莫诺苷给药组大鼠损伤脊髓组织中NeuN阳性的神经元数量显著高于对照组(P<0.05),而NeuN和Caspase-3双阳性细胞的比例明显低于对照组(P<0.05);同样,CNPase与Caspase-3双染结果显示:脊髓损伤后1w和2w莫诺苷给药组大鼠损伤脊髓组织中CNPase阳性的少突胶质细胞数量显著高于对照组(P<0.05),而CNPase和Caspase-3双阳性细胞的比例明显低于对照组(P<0.05)。(6)与对照组相比,脊髓损伤后1d、3d、1w、2w等时间点莫诺苷给药组大鼠损伤脊髓组织中的氧化应激产物H2O2、脂质过氧化物MDA、蛋白氧化产物3-NT和DNA氧化损伤产物8-OHDG等的含量均下降(P<0.05),在1d和3d达高峰。(7)脊髓损伤后1d、3d、1w、2w等时间点莫诺苷给药组大鼠损伤脊髓组织中的CAT、GSH-PX、SOD等抗氧化酶活性均显著高于对照组(P<0.05)。结论:1.莫诺苷促进SCI后大鼠损伤脊髓的组织学修复和运动功能恢复,具有神经保护作用。2.增加损伤脊髓组织的抗氧化酶活性、抑制氧化应激反应,进而促进损伤脊髓组织内神经细胞的存活,可能是莫诺苷发挥脊髓神经保护作用的重要机制之一。
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