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肠道病毒 71 型(enterovirus 71,EV71)是小 RNA 病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员,是手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。EV71主要感染5岁以下的婴幼儿,典型的临床表现为发热和手、足、口等处黏膜的疱疹;而严重者可进展为神经系统并发症,如神经源性肺水肿和无菌性脑膜炎等,甚至可导致死亡。目前,EV71的致病机制尚不清楚。而我们的前期研究显示不同毒力的病毒株复制能力存在差别,而3C和3D蛋白是影响病毒复制的关键蛋白,所以本研究将利用反向遗传技术对3C和3D蛋白在病毒毒力上发挥的作用进行研究,为EV71感染的防治提供理论依据。目的:通过对强毒株SDLY107和弱毒株SDLY1的3C和3CD编码区的置换构建并拯救重组病毒株SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD),探讨EV71的3C和3D蛋白在病毒毒力上的作用。方法:1.利用基因克隆技术构建微复制子体系pMD19-T-5’UTR-EGFP-3C-3’UTR,并在此基础上研究3C蛋白的功能。2.利用反向遗传技术,将强毒株SDLY107的3C和3CD编码区置换为SDLY1的3C和3CD编码区,构建并拯救重组病毒株SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD),用50%终点法和实时荧光定量PCR技术分别对病毒的滴度和RNA模板量进行测定。3.在细胞水平上(RD细胞和Vero细胞)对重组病毒株SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD)的复制能力和对细胞的损伤作用进行研究。4.在动物水平上(一日龄ICR乳鼠)对重组病毒株SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD)的毒力进行研究。结果:1.成功构建了微复制子体系pMD19-T-5’UTR-EGFP-3C-3’UTR,并在细胞中检测到了荧光蛋白的表达,即3C蛋白也成功表达;但微复制子体系在细胞中并不能进行复制,该体系不能用于研究蛋白在病毒复制中的作用。2.成功构建并拯救了重组病毒SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD),并利用50%终点法和实时荧光定量PCR技术分别对病毒的滴度和RNA模板量进行了测定。3.细胞试验结果:重组病毒SDLY107(1-3C)的复制能力在37℃和39.5℃条件下均没有发生改变;SDLY107(1-3C)对细胞的损伤能力也与SDLY107株没有明显的区别。而重组病毒SDLY107(1-3CD)的复制能力和对细胞的损伤能力发生改变。SDLY107(1-3CD)在37℃条件下,复制能力稍有下降,在39.5℃条件下显著下降;同时,37℃条件下,SDLY107(1-3CD)对细胞的损伤能力下降(但强于SDLY1株),而在39.5℃条件下对细胞的损伤能力显著下降(与SDLY1株没有明显区别)。以上结果说明3D蛋白存在影响病毒复制和温度敏感性的位点。4.动物试验结果:重组病毒SDLY107(1-3C)对动物的影响与SDLY1株没有区别。而SDLY107(1-3CD)组的ICR幼鼠的症状较SDLY107组轻,体重下降程度也小于SDLY107组;对小鼠后肢肌肉的病毒载量进行检测发现,重组病毒SDLY107(1-3CD)在小鼠体内的复制能力有小幅度下降;肺组织病理切片结果表明,重组病毒SDLY107(1-3CD)对小鼠的组织损伤能力降低。因此,重组病毒SDLY107(1-3CD)的毒力下降,而重组病毒SDLY107(1-3C)的毒力未发生改变。结论:1.重组病毒SDLY107(1-3CD)的毒力下降,而重组病毒SDLY107(1-3C)的毒力未发生改变,所以肠道病毒71型的3CD蛋白对病毒毒力具有重要作用。2.3CD编码区存在着影响病毒毒力(包括复制能力和温度敏感性)的位点,毒力位点可能通过3D蛋白发挥作用,也有可能与其他蛋白联合发挥作用。