论文部分内容阅读
目的：探索Liguzinediol (LZDO)对正常大鼠心脏正性肌力作用的机理。方法：1.在体大鼠左心室压力-容积关系曲线记录：采用大鼠压力-容积导管测定在体心脏左心室收缩功能,分析正常大鼠心脏在LZDO作用下左室压力与容积的关系。指标包括：心率(Heart rate, HR)、收缩末期容积(End-systolic Volume, Ves)、舒张末期容积(End-diastolic Volume, Ved)、收缩末期压力(End-systolic Pressure, Pes)、每搏输出量(Stroke Volume, SV)、射血分数(Ejection Fraction, EF)、心输出量(Cardiac Output, CO)、左室压力最大上升速率(Peak rate of rise of left ventricular pressure, +dp/dtmax)、搏出功(Stroke Work, SW)、收缩末期压力-容积关系曲线(End-systolic pressure-volume relationship, ESPVR)、舒张末期压力-容积关系曲线(End-diastolic pressure-volume relationship, EDPVR)。2.左心室心肌细胞钙成像技术：利用钙成像技术观察LZDO对大鼠正常左心室细胞钙释放的影响。3.大鼠Langendorff离体心脏灌流采用Langendorff离体心脏灌流装置灌流大鼠心脏,记录左心室收缩功能。分析LZDO在兰尼碱受体激动剂、磷酸蛋白酶抑制剂存在的条件下,对左心室发展压(Left ventricular developed pressure, LVDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)及心率(HR)的作用。4.大鼠心肌细胞肌浆网钙泵的活性测定分离正常大鼠心脏的左心室肌浆网,分析LZDO对肌浆网钙泵(Sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase, SERCA2a)活性的影响。5.蛋白质印迹法采用急性分离的大鼠细胞,分析在不同浓度的LZDO(0,1,10,100 μM)作用下心肌细胞受磷蛋白(Phospholanban, PLB) 16位丝氨酸(Ser)和17位苏氨酸(Thr)的磷酸化情况。6.大鼠心肌细胞蛋白磷酸酶的活性测定采用ProFluor(?) Ser/Thr PPase Assay kit测定心肌匀浆在不同浓度LZDO(0,1,10,100 μM)的情况下蛋白磷酸酶1和2A(PP1、PP2A)的活性。结果：1. LZDO可增强在体大鼠的心脏收缩功能。在LZDO的作用下大鼠在体心脏ESPVR的斜率显著增大,说明LZDO可明显增强大鼠左心室的收缩功能,心肌内在收缩性增强,从P-V环结果来看,在心肌收缩力明显增强时,心室被动舒张功能没有受到明显影响,EDPVR的斜率值还有少许下降的趋势,提示我们LZDO可能有提高心肌顺应性的作用。2. LZDO可显著增加左心室细胞的钙释放。LZDO 100 μM从灌流2 min开始明显增加大鼠左心室心肌细胞的钙释放,作用持续到30 min,而钙泵抑制剂Thapsigargin明显抑制钙释放,其抑制作用于30 min后达到稳定,LZDO 100 μM灌流5 min后未能对抗Thapsigargin抑制钙释放的作用。3. LZDO能对抗由咖啡因(Caffeine)引起的心脏收缩力下降的作用,而不能进一步增加蛋白磷酸酶抑制剂花萼海绵诱癌素A(CalyculinA)的正性肌力作用。Caffeine能直接引起肌浆网上兰尼碱受体开放,作用的初期能引起大量钙释放,随着时间的推移,肌浆网钙梯度下降,Caffeine引起心肌收缩力下降。LZDO 100 μM能对抗Caffeine 0.5mM 30 min引起的心肌收缩力减弱的作用(P<0.05),表明LZDO能对抗Caffeine耗竭心肌肌浆网钙浓度的作用。Calyculin A作为蛋白磷酸酶1(PP1)和2A(PP2A)的抑制剂,在4nM浓度下能显著增强离体心脏的收缩力(P<0.05),但在和LZDO 100 μM合用后正性肌力作用没有得到进一步增强(P>0.05),表明LZDO的正性肌力作用可能与心肌细胞内的蛋白磷酸酶有关。4. LZDO可增强大鼠左室心脏肌浆网钙泵的活性。在不同浓度LZDO (1,10,100 μM)的作用下,心肌肌浆网钙泵的活性有不同程度的增加,其中10μM和10μM与对照组有显著性差异并且呈剂量依赖性(P<0.05)。5. LZDO可增加PLB 16位丝氨酸和17位苏氨酸的磷酸化PLB的磷酸化增加可提高心肌收缩力,在不同浓度LZDO(1,10, 100 μM)的作用下,PLB的磷酸化程度不断升高,其中LZDO 100 μM与对照组有显著性差异(P<0.05)。6. LZDO可抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性在LZDO 100 μM的作用下PP1与PP2A的活性均有不同程度的下降,并且具有显著性差异(P<0.05)。表明LZDO可能通过影响PP1与PP2A的活性从而影响心肌收缩力。结论：通过P-V环实验可以看出LZDO的正性肌力作用在大鼠在体心脏中同样存在。LZDO可增加左室心肌细胞的钙释放,但这种作用可被肌浆网钙泵抑制剂Thapsigargin所阻断,并且LZDO可对抗兰尼碱通道过度开放而导致的肌浆网钙耗竭的情况,表明LZDO的作用靶点在肌浆网钙泵而非兰尼碱受体。在LZDO的作用下肌浆网钙泵的活性增强,PLB的磷酸化增加,PP1、PP2A的活性下降,表明LZDO的正性肌力作用与抑制PP1、PP2A活性有关。基于其良好的心脏安全特性以及有别于传统强心药的靶点,LZDO很有希望成为临床上治疗心衰的一种新型药物。