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目的：内皮氧化应激损伤参与了动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)、高血压、糖尿病等心脑血管疾病的发病过程。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-densitylipoprotein，OxLDL)、血管紧张素Ⅱ和高糖等是这些疾病的主要致内皮细胞氧化应激损伤因素。内皮细胞作为血管系统的屏障，是OxLDL、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)和高糖等危险因素共同的靶点，研究表明OxLDL、可导致内皮细胞氧化应激损伤，这也被认为是AS发生过程中的始动环节，当内皮细胞被激活后，内皮失去正常功能，分泌多种生长因子，从而激活单核细胞和淋巴细胞聚集并黏附于内皮，迁移到内皮下，大量吞噬周围被氧化的脂质从而形成单核细胞源性的泡沫细胞。与此同时，内皮细胞可产生更多的活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)，促进血脂中LDL氧化修饰，形成更多的OxLDL，加剧AS的发病进程。因此，干预内皮细胞氧化应激损伤可成为防治AS的主要手段之一。
本研究发现海洋微生物来源化合物Xyloketal B能舒张苯肾上腺素诱导大鼠胸主动脉收缩反应，并且在内皮完整条件下作用更加明显，提示该化合物可能具有调节内皮功能的作用，因此本研究开展了该化合物对OxLDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的作用与相关机制研究。本研究还将探讨Kv1.5-ROS-线粒体信号通路在内皮氧化应激损伤中的调节作用与机制。
方法及结果：
第一部分：海洋微生物来源化合物Xyloketal B对内皮细胞氧化应激损伤保护作用研究。建立OxLDL诱导内皮细胞氧化应激损伤体外模型，应用激光共聚焦显微镜扫描技术、蛋白印迹、RT-PCR、免疫荧光、MTT等方法，检测Xyloketal B对OxLDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。结果显示：
⑴OxLDL诱导内皮细胞ROS生成模型的建立。OxLDL浓度为0、7.5、37.5、75、150μg/ml作用内皮1h后，刺激内皮细胞内产生ROS水平分别增加为260.7±19.1、300.6±18.2、391.9±33.1、575.4±25.7和694.1±53.3(A.U.)，OxLDL浓度大于37.5μg/ml时与对照组相比有统计学差异(P＜0.01，n=3)，并且在150μg/ml时作用最显著。OxLDL(150μg/ml)处理内皮细胞10、30、60、90min，引起内皮细胞ROS水平改变分别为137.8±10.9、261.6±12.7、374.2±56.7、773.5±34.3和523.3±65.3(A.U.)，OxLDL作用于内皮细胞10min产生的ROS与对照组相比已有统计学差异(P＜0.01，n=3)，并且在60min时作用最明显，作用时间为90min时产生的ROS与对照组相比也明显升高，但是比60min时间点有所下降。因此采用150μg/ml OxLDL与HUVECs共孵育60min作为内皮细胞氧化应激损伤的模型。
⑵应用MTT法检测Xyloketal B对OxLDL诱导内皮细胞存活率降低的作用。发现OxLDL(150μg/ml)明显导致HUVECs存活率显著降低，为对照组的52.5±4％(P＜0.01，n=6)，给予Xyloketal B(0.32、0.63、1.26、2.5、5、10、20、40μM)预敷30min后，呈浓度依赖地抑制OxLDL引起的HUVECs存活率降低效应，用相对于对照组的百分比来表示，Xyloketal B在0.63μM时，已有明显抑制作用，与OxLDL处理组相比有统计学差异(65.0±8.9 vs.52.5±4％，P＜0.05，n=6)，在40μM时达到最大效应。Xyloketal B保护作用的IC50为1.5μM。
⑶用DAPI染核检测Xyloketal B对OxLDL引起HUVECs细胞凋亡的影响。OxLDL(150μg/ml)作用内皮细胞24h后可明显导致内皮细胞核固缩、凋亡小体形成，凋亡小体形成率从对照组的3.8±1％增加到24.7±1.3％(P＜0.01，n=6)，而0.2、2、20μM Xyloketal B预敷后，使凋亡小体数目形成率从OxLDL处理组的24.7±1.3％降低分别为23.4±3.9％，11.9±1.9％和8.0±1.4％，当XyloketalB＞2μM，抑制作用与OxLDL组相比有统计学差异(P＜0.01，n=6)。
⑷OxLDL(150μgml)孵育1h后，HUVECs的NADPH氧化酶活性明显高于对照组(OxLDL:76.3±2.6 vs.Control:33.5±1.5 RUL·s-1·mg protein-1，P＜0.01，n=4)，而给予Xyloketal B(0.2、2、20μM)预孵30min后，OxLDL诱导的NADPH氧化酶活性分别为73.0±7.6、55.6±6.2、45.6±5.5 RUL·s-1·mg protein-1。2μMXyloketal B已经显著抑制NADPH氧化酶活性过度增加，与OxLDL组相比有统计学差异(P＜0.01，n=4)。
⑸150μg/ml OxLDL与HUVECs共孵育可引起HUVECs内3-硝基酪蛋白(3-NT)表达明显增加，对照组荧光强度为679.1±101.1(A.U.)，而OxLDL处理组为1337.9±99.4(A.U.)(P＜0.01，n=3)。预孵Xyloketal B后，化合物呈浓度依赖地抑制OxLDL引起的胞内3-NT生成增多，Xyloketal B0.2、2、20μM预敷组荧光强度分别为(1240.5±93.3、923.4±22.1、797.1±39.1(A.U.))，2μMXyloketal B对OxLDL引起3-NT增加的抑制作用与OxLDL组相比已经有统计学差异(P＜0.01，n=3)。
小结：①Xyloketal B浓度依赖地抑制OxLDL诱导内皮细胞存活率降低和细胞凋亡；②Xyloketal B显著抑制OxLDL诱导内皮细胞ROS生成，降低ONOO-水平；③Xyloketal B明显抑制OxLDL诱导NADPH氧化酶活性以及特异性调节NADPH氧化酶亚基gp91 phox和p47 phox mRNA的表达增加的作用，对p67 phox mRNA的表达没有影响；④Xyloketal B促进内皮细胞NO的生成。
第二部分：内皮细胞氧化应激损伤相关分子机制研究。在观察OxLDL、AngⅡ等对内皮细胞Kv1.5蛋白表达的影响的基础上，进一步通过siRNA干扰下调Kv1.5表达以及腺病毒载体感染过表达Kv1.5，探讨了Kv1.5-ROS-线粒体信号通路在内皮氧化应激损伤过程中的作用。结果如下：
⑴Kv1.5 siRNA干扰48h有效地沉默内皮细胞Kv1.5蛋白的表达。在10nM浓度时，Kv1.5 siRNA对Kv1.5蛋白表达的干扰效率达到80％以上，后续实验以此条件进行干扰实验研究
⑵通过Western Blot检测AngⅡ和OxLDL对内皮细胞Kv1.5表达的影响。AngⅡ(2μM)处理HUVECs6、12、24h后，Kv1.5蛋白的表达呈时间依赖地增加，分别是对照组的1.34±0.30、1.78±0.45、3.34±0.6倍(P＜0.05，n=3)。AngⅡ处理HUVECs24h后，AngⅡ(0.02、0.2、2μM)组的内皮细胞Kv1.5蛋白表达与对照组相比，分别增加130.7±20、181.2±54、229.7±61％(P＜0.05，n=3)，作用呈浓度依赖性。OxLDL亦浓度依赖性促进内皮细胞Kv1.5的表达，37.5、75和150μg/ml OxLDL处理人肺动脉内皮细胞(HPAECs)24h后，Kv1.5蛋白表达与对照组相比，分别增加2.70±0.40、3.10±0.45和3.50±0.30倍(P＜0.05，n=3)。
⑶OxLDL处理细胞1h后，内皮细胞线粒体ROS水平明显升高，为对照组的3.6±0.4倍(P＜0.05,n=6)，而Kv1.5 siRNA干扰沉默或腺病毒载体过表达Kv1.5蛋白后，可显著抑制或增强内皮细胞线粒体ROS生成，线粒体ROS水平变成对照组的1.8±0.3和6.4±0.3倍，与OxLDL处理组相比有统计学差别(P＜0.05，n=6)。
⑷.OxLDL作用内皮细胞24h后导致内皮细胞肿胀、变亮等损伤表现，而Kv1.5 siRNA干扰沉默表达后则可显著减弱这种损伤形态学改变，当腺病毒载体过表达Kv1.5蛋白后，可进一步促进OxLDL对内皮细胞损伤效应。
⑸OxLDL作用内皮细胞24h后，发现UCP2蛋白的表达与对照组相比明显下降，腺病毒载体过表达Kv1.5蛋白后，进一步让UCP2蛋白表达下降。而Kv1.5siRNA干扰沉默内皮细胞Kv1.5蛋白后，则可部分恢复UCP2蛋白的表达。
结论：①Xyloketal B对OxLDL诱导内皮细胞氧化应激损伤有保护作用，作用机制与降低细胞内ROS水平，促进NO释放，从而降低过氧化亚硝基水平等环节有关。②Kv1.5-ROS-线粒体信号通路参与了OxLDL诱导内皮细胞氧化应激损伤密切相关，Kv1.5蛋白表达的沉默或者过表达能抑制或者增强OxLDL诱导内皮细胞ROS以及线粒体ROS水平，其影响线粒体ROS生成可能与调节线粒体UCP2蛋白的表达有关。