第一部分c-FLIP、浆／核β-catenin的表达及二者表达的相关性研究目的观察细胞型FAS结合蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白（cellular FADD-likeinterleukin -1βconvening enzyme inhibitory protein，c-FLIP）、浆／核β-连环蛋白（β-catenin）在恶性黑素瘤组织、色素痣、银屑病及正常包皮组织中的表达，探讨两者的相关性。方法以20例色素痣组织及20例正常包皮作为对照，应用免疫组织化学方法检测77例恶性黑素瘤组织，20例银屑病组织中c-FLIP、浆／核β-catenin的表达，对蛋白表达行半定量分析。结果c-FLIP、浆／核β-catenin、周期素蛋白D1（cyclinD1）在77例恶性黑素瘤组织中的阳性表达率分别为65.0％、32.5％和31.2％，且三者的表达有相关性；c-FLIP的表达在黑素瘤组织中明显增高，且与组织类型相关；在正常色素痣中c-FLIP、浆／核β-catenin及cyclinD1无阳性表达或偶见阳性表达。银屑病组织中c-FLIP的表达增强，与正常对照相比，差异有显著性；几无浆／核β-catenin的表达；在银屑病组织中未观察到三者有MM中的类似关系。结论c-FLIP高表达可能参与MM的发生、发展；在MM中高表达的c-FLIP可能与β-catenin的浆／核表达有关，从而影响β-连环蛋白／T细胞因子（β-catenin／TCF）下游基因cyclinD1的表达。第二部分pCMV-Tag2B-FLIP_L／P43／S以及c-FLIP-shRNA载体的构建和表达目的构建细胞FLICE蛋白（c-FLIP）和pCMV-Tag2B融合蛋白基因的重组真核表达载体pCMV-Tag2B-FLIP_L、pCMV-Tag2B-FLIP_S和pCMV-Tag2B-FLIP_p43。并转染至A375细胞中进行表达，鉴定融合蛋白的生物学活性。针对c-FLIP各亚型共有靶点设计shRNA分子，连接于真核表达载体pSilencer 3.1-H1 neo，构建pSilencer-c-FLIP质粒，下调c-FLIP的表达。为后续实验奠定基础。方法从白血病Jurkat细胞中提取总RNA，分离提取mRNA，逆转录获得cDNA。设计三对引物引入酶切位点xhoⅠ和EcoRI，再用PCR的方法，分别扩增FLIP_L、FLIP_P43和FLIP_S序列。将获得的基因克隆至pGEM-T载体（FLIP-T），转化大肠杆菌DH5a，进行蓝白筛选，挑取阳性克隆扩增。提取质粒以xhoⅠ、EcoRI双酶切鉴定，并测序证实正确后，亚克隆至pCMV-Tag 2B，获得pCMV-Tag 2B-FLIP_L／P43／S，转染A375细胞，获得稳转细胞系。设计针对c-FLIP的shRNA，酶切pSilencer 3.1-H1 neo后，将合成的shRNA通过BamHⅠ和HindⅢ连接于载体，构建真核载体，表达siRNA。结果测序结果表明获得了正确的FLIP_L、FLIP_P43和FLIP_S基因序列；亚克隆至pGEM-T载体后，xhoⅠ和EcoRI双酶切可见约1.4Kb、1.1Kb和0.6kb的小片段和约4.3Kb的大片段，与理论计算值相符，表明pCMV-Tag 2B-FLIP_L、pCMV-Tag 2B-FLIP_P43和pCMV-Tag 2B-FLIP_S真核表达载体构建成功；表达载体转染A375细胞，G418筛选后用westernblot、流式分析鉴定其为稳定转染细胞株。成功pSilencer-c-FLIP构建，转染入黑素瘤细胞中，能够下调c-FLIP各亚型的表达。结论成功构建pCMV-Tag 2B-FLIP_L／P43／S融合蛋白的真核表达载体，融合蛋白可在A375细胞中表达；成功构建pSilencer-c-FLIP载体，在黑素瘤细胞中能够下调c-FLIP各亚型的表达，本实验为进一步研究FLIP对β-catenin／TCF通路的影响奠定基础。第三部分c-FUP_L／P43通过β-catenin／TCF激活cyclinD1的表达目的观察c-FLIP的改变是否激活β-catenin／TCF通路，引起下游基因的变化；观察c-FLIP各亚型在上述作用中的差异。方法利用pCMV-Tag-2B-c-FLIP真核表达载体上调低表达c-FLIP的黑素瘤A375细胞系中各亚型c-FLIP的表达水平，用western blot及细胞免疫荧光观察β-catenin定量、定位的改变；用TOP／FOP双荧光报告基因分析观察转录因子TCF的活性，判断是否通过β-catenin／TCF路径启动下游基因的转录；western blot检测β-catenin／TCF路径下游基因cyclinD1蛋白水平的改变；比较c-FLIP各亚型在上述过程中的作用差异；同时利用pSilencer-c-FLIP载体下调c-FLIP各亚型的水平，观察对上述过程的影响，明确c-FLIP各亚型功能特异性。结果在A375细胞中，高表达c-FLIP_L／P43可以增加胞核及胞浆中β-catenin的表达；通过TOP／FOP双荧光报告基因检测，证明确实通过β-catenin／TCF路径启动下游基因的转录；检测下游基因cyclinD1的蛋白水平明显升高。行RNA干扰c-FLIP的表达后，上述结果部分逆转。但在高表达c-FLIP_S的细胞中并未表现出上述现象。结论过度表达c-FLIP_L／P43可以异常激活β-catenin／TCF路径，诱导下游基因的表达。第四部分c-FLIP对A375细胞生物学特性的影响目的观察c-FLIP各亚型对A375细胞的生长、增殖、凋亡及转化能力的影响。方法在pCMV-Tag-2B-c-FLIP_L／P43／S稳定转染细胞中，运用绝对细胞计数对c-FLIP各亚型稳定转染细胞绘制生长曲线，比较其与对照组的差异；用MTT法检测各稳定转染细胞增殖能力的差异；用Annexin v／PI双染细胞，检测各组细胞凋亡率的差异；用双层软琼脂克隆形成实验检测各组细胞体外转化能力的差异。同时运用shRNA干扰，下调c-FLIP各亚型的表达，验证c-FLIP所产生的细胞生物学特异改变的特异性。结果A375／c-FLIP_L／p43／S细胞的生长速度均快于A375／Control细胞，其中，A375／c-FLIP_L与A375／c-FLIP_P43细胞的生长速度基本一致，A375／c-FLIP_S较二者慢；行MTT法检测细胞增殖能力，与细胞生长曲线结果类似，A375／c-FLIP_L／p43／S细胞增殖能力强于A375／Control细胞，其中，A375／c-FLIP_S细胞增殖能力略低于A375／c-FLIP_L及A375／c-FLIP_P43细胞；Annexin v／PI双染检测细胞凋亡率，A375／c-FLIP_L／p43／S细胞略低于A375／Control细胞；行双层软琼脂克隆形成实验，A375／c-FLIP_L／p43／S细胞克隆形成率高于对照细胞，其中，A375／c-FLIP_L与A375／c-FLIP_P43细胞克隆形成率高于A375／c-FLIP_S细胞。用shRNA干扰，下调c-FLIP各亚型的表达，上述效应部分得到逆转。结论c-FLIP各亚型均可以促进细胞生长、增殖及转化，其中c-FLIP_L及c-FLIP_P43的能力更强，但在抗凋亡效应中，c-FLIP的三种亚型未表现出显著差异。