研究背景:延迟的伤口愈合、皮肤溃疡及心脑血管多见的缺血梗死是糖尿病患者常见的主要的并发症,而这些并发症缓慢发展,迁延难愈,导致了患者非常高的病残率及病死率,极大地破坏了患者生活质量,显著地缩短了患者的预期寿命,并造成一系列的社会卫生与健康相关问题。破溃组织的修复与愈合,是一个极其复杂的过程,牵涉到凝血、炎症、血管生成、组织修复和重塑等多种机制,而参与这一复杂过程的又包括干细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和角质细胞等多个种系的细胞,其中,血管生成是这一过程的关键环节,而血管内皮的结构及功能的完整性对此有着十分重要的作用,而实现这一作用的基本单元就是血管内皮细胞。在糖尿病及代谢综合征患者中,目前已被证实由于游离脂肪酸的升高导致其体内应激状态及代谢压力明显升高,而这种应激和压力已被证明可以导致内皮细胞激活并进一步抑制血管生成,最终导致延迟的伤口愈合及多发的血管并发症,然而直到目前为止,这种由于过高的游离脂肪酸导致的内皮的破坏及功能障碍的潜在的机制仍知之甚少,所以对于这种机制的研究与探索,进一步明确其病理生理的发生与发展过程,对于预防、治疗、减少或治愈糖尿病人及代谢综合征患者的血管并发症有着重要的价值与意义。血管生成是一个复杂的过程,涉及多种信号通路及诸多功能蛋白分子的参与调节。而作为经典的细胞增殖与凋亡及周期调节通路-HIPPO信号通路及其核心功能蛋白-YAP,被证实在人体各组织和细胞中有着广泛的表达,而其在血管内皮细胞中也有着明显的表达与作用,其主要的生理功能包括,调节细胞的增值与凋亡;调节组织与器官的增生与修复;调节细胞间接触性抑制;参与内环境的稳态调节,而近来的研究报道中发现,这条通路对于维持内皮细胞的功能及内皮完整性同样有着重要的作用。HIPPO通路主要成员包括:MST1/2、SAV、LATS1/2,及其效应元件YAP,YAP被去磷酸化后激活,激活后的YAP可以促进细胞增殖及存活,并促进血管生成。而当上游的MST1/2被磷酸化后激活,进一步磷酸化并激活LATS1/2,激活后LATS1/2会导致YAP丝氨酸127位点(S127)或丝氨酸381位点(S381)发生磷酸化,而磷酸化后的YAP将失去活性,停留在细胞质内并可能被降解,使其无法进入细胞核启动下一步目的基因的转录与翻译,HIPPO信号通路正是通过这种对于YAP的复杂的调控来干预细胞的存活、增殖,并影响血管新生,所以,在HIPPO通路中,YAP起着十分关键的作用。线粒体的功能状态对于维持内皮细胞的稳定及完整性有着十分重要的作用,除外为细胞的代谢及功能维持提供能量外,线粒体广泛的参与到内皮细胞的氧化还原调节当中,近来的报道指出,线粒体的动力学对于维持维持内皮细胞的动态平衡有着重要的作用,由于线粒体易受氧化应激发生去极化导致线粒体膜完整性破坏,其内的线粒体DNA(mtDNA)将会进入细胞质,进而被DNA感受器识别后激活下游相关分子与通路。作为固有免疫的识别与应答及炎症的调节分子,STING可以特异地识别进入细胞浆的mtDNA并被其激活,进而招募TBK1形成复合物,进一步激活转录因子IRF3,启动下游一系列信号转导和分子调节。研究报道表明,STING参与了内皮细胞的激活,其过度激活也与内皮细胞炎症有着密切的关系,并且一种与STING有关的血管病变也被发现,而STING在线粒体损伤及内皮细胞激活中的作用及机制尚不完全清楚,尤其是与其相关的血管病变的机制与研究,可能为代谢综合征及糖尿病血管病变的研究与治疗带来新的靶点。研究目的:研究棕榈酸对于人主动脉内皮细胞功能及血管生成的影响;阐明HIPPO信号通路在血管内皮细胞及其血管生成中的作用;探讨HIPPO信号通路与STING-IRF3信号通路在棕榈酸诱导下的相互间作用与影响;研究线粒体损伤及mtDNA在血管内皮细胞中的作用,阐明在血管内皮细胞中,棕榈酸刺激下线粒体损伤对于STING-IRF3信号通路及血管生成的影响。研究方法:1.细胞培养及转染:使用5%血清的内皮细胞专用培养基(ECM)于5%C02,37 °℃细胞专用孵箱中培养人主动脉内皮细胞。细胞基因沉默采用lipofectamine 2000配合siRNA进行,采用1X Opti-MEM培养基转染6小时后更换条件培养基,转染过程按照生产商说明书进行;过表达基因采用lipofectamine3000及P3000转染试剂在1X Opti-MEM中进行,操作过程参照生产商说明书。2.棕榈酸(PA)的配置及对内皮细胞的处理:采用白蛋白包被法,将用乙醇溶解好的PA按比例滴入到20%不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白溶液配制成0-5mM的PA储存液冷冻于-20°℃中保存。在使用PA刺激内皮细胞时使用ECM培养基按10倍比例稀释PA存储液至工作液浓度0-0.5mM后处理人主动脉内皮细胞至不同时间点,并按实验需求进行后续必要处置。3.蛋白提取及Western blot实验:细胞处理完毕后使用Western及IP专用细胞裂解液严格按照说明书提取细胞蛋白,调节蛋白浓度并于95℃变性后于-20℃或-80℃保存,新鲜的蛋白提取液或于4℃复温的蛋白提取液使用SDS-PAGE凝胶进行电泳分离后转移至PVDF膜,封闭后4°℃过夜孵育一抗,采用辣根过氧化物酶二抗配合ECL化学发光液及化学发光仪曝光并显影目的蛋白条带,条带的分析采用Image J软件。4.免疫荧光实验:细胞预先接种至铺置10mm细胞爬片的6孔板中,处理完毕后采用免疫荧光专用固定液固定后使用Triton X 100打孔,采用10%山羊血清或1%BSA封闭后孵育一抗,采用荧光二抗及DAPI孵育后使用激光共聚焦荧光显微镜或EV0S倒置荧光显微镜观察拍照。5.BrdU荧光增殖实验:培养基中按10ug/ml的浓度于处理结束前6小时加入BrdU试剂,基本过程同免疫荧光实验,Triton X 100打孔后,使用2mol/L的HCL溶液进行染色质固定及PH8.3的0.lmol/L的硼酸钠中和后继续封闭、孵育一抗、二抗、DAPI及激光共聚焦荧光显微镜显影拍照过程。6.BrdU流式增殖实验:细胞接种至6孔板中,培养基中按10ug/ml的浓度于处理结束前6小时加入BrdU试剂,处理完毕后使用0.125%胰酶消化悬浮细胞,保持细胞悬浮状态下进行4%多聚甲醛固定、Triton X 100打孔、染色质固定、封闭及孵育1抗过程,使用流式细胞仪检测样品,结果分析采用Flowjo 10.0流式软件或kaluza 1.5a专用流式分析软件进行。7.划痕/迁移实验:内皮细胞于6孔板使用条件培养基培养至100%融合后使用200ul黄色移液器枪头制造划痕,并于不同时间点观察并记录划痕宽度,采用(最初划痕面积-时间点面积)/最初划痕面积的比率评价细胞迁移效果,采用EV0S倒置荧光显微镜拍照,结果分析采用Image J软件。8.管形成实验:体外实验采用基于Matrigel的管形成实验模拟血管新生,Matrigel于4°℃融化后,铺于预冷的96孔板中,随后于37°℃细胞孵箱中孵育半小时使Matrigel凝固,内皮细胞处理完毕后采用胰酶消化并用ECM培养基重悬细胞后计数,将重悬的细胞按照每孔8000-12000加入,于不同时间点观察并记录图像,测量所成小管的总长度,结果分析采用Image J软件。9.Real-time RT-PCR:使用Trizol法提取处理好的内皮细胞的总RNA,逆转录后进行实时定量PCR检测相关蛋白mRNA表达水平的改变。10.线粒体膜电位检测:采用JC-1染色,内皮细胞处理完毕后吸去培养基,按照说明书采用JC-1工作液染色后使用JC-1染色缓冲液冲洗后加入ECM培养基后采用EV0S倒置荧光显微镜拍照;对于酶标仪检测:细胞处理完毕后采用胰酶收集细胞后重复上述过程,ECM培养基重悬后采用酶标仪检测膜电位水平。11.免疫染色质沉淀实验(chip):内皮细胞于直径10cm细胞培养皿中处理完毕后,使用1%甲醛交联后给予SDS裂解,超声粉碎细胞DNA,IRF3 一抗结合及DNA提取后,通过实时定量PCR比较不同组表达基因表达水平差异。12.统计学分析:定量数据以x±SD表示。以独立样本t检验进行组间比较,采用One-wayANOVA检验进行多组间比较。以P<0.05为有统计学意义。研究结果:1.棕榈酸能抑制血管内皮细胞增殖、迁移及体外基质的血管新生:(1)BrdU增殖实验表明,加入PA处理后,人主动脉内皮细胞的增殖程度明显受到抑制,并且这种抑制随着PA浓度的升高变得更加明显。(2)划痕/迁移实验表明,PA可以明显抑制人主动脉内皮细胞的迁移,而且呈现明显的浓度梯度性(3)体外管形成实验表明,PA的存在的可以明显抑制人主动脉内皮细胞形成新的血管,随着PA的浓度升高,人主动脉内皮细胞形成新的、更多的血管的能力被明显的削弱。2.PA可以明显激活MST并且影响YAP的功能及细胞定位:(1)通过Western blot可以看出,加入PA后MST磷酸化明显增加,并且MST总蛋白含量较对照组有所升高,而YAP的磷酸化同样较对照组明显增加。(2)通过细胞免疫荧光实验结果显示,PA的存在明显阻止YAP的核转位,加入PA后绝大多数的YAP无法进入细胞核而滞留在细胞浆中,说明PA的存在抑制了 YAP的功能。(3)BrdU增殖实验表明,过表达YAP或人工突变YAP S127磷酸化位点致使YAP不能被正常磷酸化后,明显刺激了内皮细胞增殖及抵御PA刺激伤害的能力,增加了内皮细胞在PA中存活的能力。(4)体外管形成实验表明,过表达YAP或人工突变YAP S127磷酸化位点可以促进内皮细胞的血管生成能力,并且即使在有PA的刺激下,内皮细胞较之对照组仍形成了更多的新生血管。3.MST1参与了 PA对于内皮细胞功能和血管生成的调节:(1)Western blot实验中可见,加入PA后增加了 YAP的磷酸化水平,而当下调/沉默MST1基因表达时,PA对于YAP的磷酸化出现明显的减弱,表明PA正是通过MST1磷酸化了 YAP。(2)细胞免疫荧光实验可见,PA在对照组增加了 YAP在细胞质中的滞留,阻止了 YAP进入细胞核,而当下调/沉默MST1基因表达后,更多的YAP得以进入细胞核中,PA的阻止效果被明显削弱。(3)BrdU增殖实验表明,下调/沉默MST1基因表达可以明显刺激内皮细胞增殖并明显加强了内皮细胞抵御PA刺激伤害的能力,增加了内皮细胞在PA中存活的能力。(4)体外管形成实验表明,下调/沉默MST1基因表达可以促进内皮细胞的血管生成能力,并且即使在有PA的刺激下,内皮细胞较之对照组仍形成了更多的新生血管。4.PA导致了线粒体的损伤并且这种损伤激活了 cGAS-STING-IRF3通路:(1)线粒体膜电位检测说明,PA引起了线粒体膜电位的去极化,导致了线粒体膜的不稳定及破坏,并且这种破坏在PA加入的早期便开始发生。(2)细胞免疫荧光实验及实时定量PCR实验表明,加入PA后线粒体结构发生变化,在胞浆中可见更多的双链DNA的存在,说明线粒体损伤后出现了更多的损伤的mtDNA。(3)Western blot实验表明,PA早期导致了线粒体的损伤,并且激活了CGAS-STING-IRF3通路及影响了 HIPPO通路,而这种作用呈现一定的时间先后性及顺序性。(4)Western blot实验及细胞免疫荧光实验可见,使用CCCP制造线粒体损伤后,cGAS-STING-IRF3依旧被激活,蛋白表达水平明显变化,而加入CCCP后明显增加了 IRF3的核移位及导致STING在核周大量聚集,说明线粒体损伤的确激活了 cGAS-STING-IRF3通路。5.cGAS-STING-IRF3通路参与了 PA对于HIPPO通路的调节:(1)Western blot实验表明:加入PA后可以激活cGAS-STING-IRF3通路及影响HIPPO通路,而无论下调/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一环节时,PA对于HIPPO通路的影响均明显被削弱,说明cGAS-STING-IRF3通路参与了PA对于HIPPO的影响和调节。(2)细胞免疫荧光实验进一步表明,当下调/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一环节时,PA对于HIPPO通路核心蛋白YAP的核转位的阻止受到了明显的削弱,进一步证明cGAS-STING-IRF3通路参与了 PA对于HIPPO的影响和调节。6.PA激活了 IRF3并增加了 IRF3与MST1启动子序列中结合从而促进MST1表达:(1)PA的刺激可以增加MST1基因表达水平,而当下调/沉默STING-IRF3后,MST1的基因水平较对照组出现明显减少。(2)通过分析MST1启动子基因序列发现,其上有多个IRF3结合位点。(3)免疫染色质沉淀实验表明:PA及CCCP的刺激诱导并增加了 IRF3与MST1启动子序列的结合。7.cGAS-STING-IRF3通路参与到了 PA对于内皮细胞功能及血管生成的调节当中:(1)BrdU增殖实验表明,下调/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一环节基因表达可以明显刺激内皮细胞增殖并明显加强了内皮细胞抵御PA刺激伤害的能力,增加了内皮细胞在PA中存活的能力(2)体外管形成实验表明,cGAS-STING-IRF3通路中任一环节基因表达可以促进内皮细胞的血管生成能力,并且即使在有PA的刺激下,内皮细胞较之对照组仍形成了更多的新生血管。结论:(1)棕榈酸能够明显抑制内皮细胞功能,增加其凋亡,抑制其体外基质的血管新生。(2)棕榈酸可以影响HIPPO通路功能状态及其关键蛋白的表达水平。(3)HIPPO信号通路参与到了棕榈酸对血管内皮细胞的抑制当中。(4)棕榈酸可以导致线粒体损伤并能激活cGAS-STING-IRF3通路(5)cGAS-STING-IRF3通路参与到了棕榈酸对HIPPO通路的调节当中。(6)cGAS-STING-IRF3通路参与到了棕榈酸对血管内皮细胞的抑制当中。