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哺乳动物被毛的经济价值越来越高,其性状研究也越来越热,毛色是其重要性状之一,其中黑色素含量的不同是毛色不同的关键因素。通过对黑色素合成相关基因调控机制的研究,可为动物遗传育种中选育优质丰富毛色的动物提供理论依据。为研究microRNA-182-5p(miR-182-5p)和 microRNA-96-5p(miR-96-5p)分别在羊驼黑色素细胞中对色素形成相关基因的调控机制,本试验首先对体外培养羊驼黑色素细胞的消化条件进行优化,通过转染成熟体miR-182-5p和miR-96-5p系列物,使它们在体外培养的羊驼黑色素细胞中差异表达,最后运用qRT-PCR和免疫组织化学方法,分析MITF、TYR、TYRP1和TYRP2在mRNA和蛋白水平上的表达量变化,同时使用酶标仪测定了黑色素含量。研究结果:胰蛋白酶消化体外培养羊驼黑色素细胞的最佳时间为7 min,活细胞率达到最高(P<0.01)。qRT-PCR分析显示:在羊驼黑色素细胞中,转染miR-182-5p mimic组与空白组相比,miR-182-5p是原表达水平的72.29倍(P<0.001),MI7F表达无明显变化(P>0.05),TYR、TYRP1和TYRP2表达量均降低,差异极显著(P<0.01);转染miR-182-5p inhibitor组与空白组相比,MITF表达无明显变化(P>0.05),TYR、TYRP1和TYRP2表达量均升高,差异极显著(P<0.01)。转染miR-96-5p mimic组与空白组相比,miR-96-5p是原表达水平的55.65倍(P<0.001),MITF表达无明显变化(P>0.05),TYR、TYRP1和TYRP2表达量均降低,差异极显著(P<0.01);转染miR-96-5p inhibitor组与空白组相比,MITF表达无明显变化(P>0.05),TYR、TYRP1和TYRP2表达量均升高,差异极显著(P<0.01)。免疫组织化学结果显示:转染miR-182-5p mimic组与空白组相比,MITF、TYR、YRP1和TYRP2蛋白相对表达量均降低,差异极显著(P<0.01);转染miR-182-5p inhibitor组与空白组相比,MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白相对表达量均升高,差异极显著(P<0.01)。转染miR-96-5p mimic组与空白组相比,MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白相对表达量均降低,差异极显著(P<0.01);转染miR-96-5p inhibitor组与空白组相比,MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白相对表达量均升高,差异极显著(P<0.01)。运用酶标仪测定各试验组和对照组的黑色素含量,结果显示,转染miR-182-5p mimic和miR-96-5p mimic与空白组相比,黑色素含量均降低,差异极显著(P<0.001),转染miR-182-5p inhibitor 和 inhibitor 与空白组相比,黑色素含量均升高,差异极显著(P<0.001)。综上所述:胰蛋白酶最佳消化时间为7 min;miR-182-5p和miR-96-5p均可与转录因子MITF的mRNA靶向结合,下调其下游基因TYR、YRP1和TYRP2的表达,从而抑制黑色素合成。