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大肠杆菌(Escherichia coli)是畜牧业临床上最为常见的菌株之一,致病性大肠杆菌则可引起人和畜禽的局部或全身性感染,引起畜禽尤其是幼龄畜(禽)腹泻,炎症甚至败血疾病等。喹诺酮类药物是临床上常用的药物之一,滥用及错误的给药方式使大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药严重,近年来,北京、新疆、广西等地大肠杆菌喹诺酮类药物耐药率均为60%以上。牛磺酸氯胺(Tau Cl)是牛磺酸在机体炎症环境下产生的一种卤代产物,具有良好的抗菌活性,能够有效杀灭多种革兰氏阳性、革兰氏阴性菌、真菌、灭活病毒、杀死多种寄生虫,还被证明通过氧化细菌蛋白质的硫醇和芳香族氨基酸来中和肠出血性大肠杆菌的志贺毒素,抑制铜绿假单孢菌的生物膜形成。本实验拟通过检测牛磺酸氯胺作用前后大肠杆菌对喹诺酮类抗生素耐药变化,外排泵Acr AB-Tol C及毒力基因Omp C、Omp Fm RNA表达量变化情况,分析牛磺酸氯胺消减大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药性的作用及机理,为牛磺酸氯胺作为抗菌药物研发和应用奠定理论基础。本实验采用二倍微量肉汤稀释法测定盐酸环丙沙星对大肠杆菌的MIC,并采用多步法诱导大肠杆菌ATCC5922耐药;采用微量棋盘稀释法测定盐酸环丙沙星联合牛磺酸氯胺测定两种药物联合抗菌的分级抑菌浓度(FIC);采用酶标比浊法测定不同浓度的牛磺酸氯胺对耐药菌生长曲线的影响;分别用16m M/L、10m M/L、8m M/L、4m M/L牛磺酸氯胺连续作用32MIC、64MIC耐药菌18h,确定牛磺酸氯胺最佳作用浓度,并用该浓度牛磺酸氯胺连续作用三株耐药株,采用微量肉汤稀释法及K-B药敏纸片法测定牛磺酸氯胺作用前后三株耐药菌的MIC和抑菌圈直径;应用荧光定量PCR技术检测牛磺酸氯胺作用前后大肠杆菌外排基因acr A、acr B、tol C及其调控基因mar A、rob基因及毒力基因Omp C、Omp F基因m RNA的表达量。实验结果显示:(1)盐酸环丙沙星诱导ATCC25922标准株,得到三株不同程度的耐药菌株,耐药性分别是ATCC25922的32倍、64倍、128倍;(2)牛磺酸氯胺对盐酸环丙沙星的MIC值均为16m M/L(原药物浓度为550m M/L),说明牛磺酸氯胺抗菌活性良好;(3)盐酸环丙沙星和牛磺酸氯胺联合应用FIC值均为0.5
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