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目的用携带人血小板源性生长因子-B (platelet-derived growth factor-B, PDGF-B)基因的真核表达质粒EX-A0380-M03转染Beagle犬牙龈成纤维细胞,复合脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix, ADM)体外构建组织工程化复合物,移植修复犬慢性Ⅱ。根分叉病变,探讨hPDGF-B基因修饰的牙龈成纤维细胞在牙周组织再生中的作用,为基因治疗与组织工程联合应用于牙周组织缺损再生治疗奠定基础。方法1.借助改良组织块法+半消化法分离培养Beagle犬牙龈成纤维细胞,手术、免疫细胞化学以及碱性磷酸酶法确定细胞来源;2.观察DMEM、RPMI1640两种培养液对Beagle犬牙龈成纤维细胞体外生物学活性的影响;3.转化、扩增、鉴定携带hPDGF-B基因的质粒EX-A0380-M03,并利用脂质体将其转入Beagle犬牙龈成纤维细胞;RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA以及Western Blot检测目的基因的转录和表达。4.体外基因转染后,观察细胞形态变化,MTT及流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡的情况。Realtime PCR法检测转染细胞I型胶原、XII型胶原以及α-SMA表达的变化。5.组织学及扫描电镜观察细胞与ADM复合情况;将基因修饰的Beagle犬牙龈成纤维细胞与ADM复合,并将复合的组织工程化复合物植入裸鼠皮下,于2、4、8周了解基因修饰的工程化复合物体内再生情况。6.人工构建5条Beagle犬慢性II。根分叉病变模型,将转染目的基因的牙龈成纤维细胞与未转染细胞分别以5×10~6个/mL接种于ADM上,覆盖于根分叉缺损外侧,12周后处死动物,观察牙龈再生的情况。制备颊舌向病理切片,HE染色观察牙周组织再生情况。结果1.分离培养的细胞为来源于中胚层的成纤维样细胞。2.DMEM和RPMI1640对Beagle犬牙龈成纤维细胞的游出成功率、增殖以及I型胶原的表达无显著性差异。3.酶切和DNA测序鉴定证实EX-A0380-M03上携带的外源基因为hPDGF-B;EX-A0380-M03脂质体法瞬时转染牙龈成纤维细胞获得成功,部分细胞发出绿色荧光,转染效率为18%-38%。RT-PCR、免疫细胞化学染色和ELISA检测表明,hPDGF-B在牙龈成纤维细胞中得到了有效表达。Western Blot证实转染细胞合成的蛋白为PDGF-BB—eGFP融合蛋白。4.目的基因转染后细胞形态部分发生变化,增殖显著增强,凋亡率无明显变化。转染细胞I胶原表达上调,而XII型胶原和α-SMA表达下调。5.ADM与牙龈成纤维细胞复合后,在其表面和内部生长良好。植入裸鼠皮下后,未转染细胞在ADM上形成类结缔组织,而转染细胞则与ADM形成类骨质样结构。6.基因强化的组织工程化复合物治疗后,转染细胞组与未转染细胞组在龈退缩上无显著性差异(P>0.05),但均优与单纯膜组(P<0.05)。转染细胞组颊侧牙周膜、牙骨质及牙槽骨的质量优于未转染组和单纯膜组。结论1.体外成功分离培养Beagle犬牙龈成纤维细胞;2.DMEM和RPMI1640两种培养液均适合Beagle犬牙龈成纤维细胞的培养;3.hPDGF–B基因可在牙龈成纤维细胞内有效表达;4.hPDGF-B基因转染可提高牙龈成纤维细胞的增殖速率,并通过胶原堆积促进牙周组织的再生;5.ADM生物相容性良好,既可作为支架、也可作为屏障膜用于引导组织再生术;6.hPDGF-B基因强化的组织工程化技术是修复牙周组织缺损的一种较好方法,具有良好的临床应用前景。