鼠李糖乳杆菌微胶囊的制备及其胞外多糖对小鼠肠道菌群的调节作用

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益生菌及益生菌胞外多糖有调节机体肠道菌群平衡、提高机体免疫力、降胆固醇、降血脂等功能。但益生菌对人体内胆汁盐、胃液中酸性环境的耐受性差,这就会限制其益生功能的发挥。利用微胶囊技术保护益生菌是目前国内外研究的热点。本文优化了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ZFM231微胶囊的最佳包埋条件,并研究了其储存稳定性以及在模拟胃液中的耐受性和模拟肠液中的释放性能。本文采用水提醇沉法提取鼠李糖乳杆菌取胞外多糖,并对其进行了化学成分分析和结构表征。通过建立葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium salt,DSS)诱导的急性结肠炎小鼠模型,研究鼠李糖乳杆菌ZFM231胞外多糖对小鼠肠道菌群的影响,并研究其发挥作用的机制。从而为鼠李糖乳杆菌及其胞外多糖相关功能性食品的研发提供理论基础。主要研究结果如下:1.本文采用内源乳化冷凝法制备鼠李糖乳杆菌微胶囊,制备工艺用单因素试验和响应面法进行优化,得到优化后制备微湿胶囊工艺为:鼠李糖乳杆菌微湿胶囊的最优包埋工艺为乳清蛋白浓度为7.6%、转速为800 r/min、乳化时间为2.9 h、水油比为1:4。在此基础上对保护剂进行筛选,确定了果胶为保护剂,其添加比例为2:4(菌液:果胶)。采用优化后工艺制备微胶囊冻干粉,鼠李糖乳杆菌的包埋率达77.71±2.05%,得到的微胶囊的粒径为172±1.8μm。2.利用体外模拟胃液模型评价了微胶囊冻干粉对鼠李糖乳杆菌的保护作用。结果表明,在经过模拟胃液处理90 min后微胶囊中活菌数从8.78下降到5.82 log(CFU/mL),与未包埋的鼠李糖乳杆菌相比(活菌数从8.89降到了3.90 log(CFU/mL)),明显减缓了活菌数的减少。在模拟肠液中处理90 min后菌活力为7.60 log(CFU/mL),此时的释放率为86.56%。将经过包埋的鼠李糖乳杆菌在4℃的条件下储存28天,微胶囊的活菌数由8.78 log(CFU/mL)减少到7.32 log(CFU/mL),而未包埋的鼠李糖乳杆菌的活菌数由8.89log(CFU/mL)减少到4.50 log(CFU/mL),表明鼠李糖乳杆菌微胶囊的储藏稳定性大大提高。3.采用水提醇沉法提取鼠李糖乳杆菌胞外多糖(EPS),并用多种大孔树脂对EPS的脱色效果进行了筛选。结果表明大孔树脂D4020效果最好,其脱色率达到75%。化学组分分析表明,经脱色后的EPS的总糖、蛋白质、硫酸基和糖醛酸的含量分别为44.00%、3.65%、12.16%和13.00%。采用离子色谱法测定了EPS的单糖组成,发现EPS主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖和少量鼠李糖和葡萄糖醛酸组成。紫外图谱分析表明EPS可能含有少量蛋白质,几乎不含核酸及色素等杂质。高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测得多糖相对分子量为1.32×104;红外光谱显示在820 cm-1、915 cm-1、1060cm-1、1230 cm-1、1400 cm-1、1650 cm-1、2930 cm-1、3400 cm-1处有多糖的特征吸收峰。核磁共振氢谱分析表明,EPS中各单糖主要通过β-型糖苷键相连接。4.通过建立DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型,研究鼠李糖乳杆菌ZFM231胞外多糖对小鼠肠道菌群的影响,得到以下结果:(1)采用低(100 mg/kg)、中(300 mg/kg)、高(600 mg/kg)三个剂量的EPS治疗急性结肠炎小鼠,其宏观疾病症状得到缓解。发现中、高剂量的EPS治疗效果明显,小鼠的体重下降、结肠变短以及小鼠结肠黏膜损伤等现象得到显著改善,DAI评分也明显下降。这些结果表明EPS的处理对溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)小鼠有较好的治疗作用。(2)采用16S rDNA高通量测序技术和生物信息统计分析方法探究了EPS对急性结肠炎小鼠肠道微生态的影响,结果发现与正常组相比,DSS诱导的急性结肠炎小鼠中肠道菌群发生了变化,组间的菌群相似度降低,而经EPS治疗后小鼠肠道菌群发生了一定程度的恢复,组间的相似度得到提高。与模型组相比,经过EPS治疗的小鼠肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)明显降低,表明EPS可以通过缓解炎症来恢复结肠炎小鼠肠道菌群的结构失衡。经过治疗的小鼠的厚壁菌门明显减少,拟杆菌门和疣微菌门则明显增加。与模型对照组相比,经过EPS治疗的小鼠肠道微生物代谢生成的乙酸、丙酸和丁酸明显增多。(3)经过EPS治疗后的急性结肠炎小鼠,其结肠细胞中抗炎因子TGF-β含量显著升高,而促炎因子TNF-α的含量显著降低。这些结果表明EPS的处理使UC小鼠的炎症得到明显缓解。
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