1研究背景肝郁脾虚证是中医常见证候,可见于抑郁症、腹泻型肠易激综合征、慢性肝病、亚健康等临床多种疑难病症的不同阶段。在这些难治性疾病的治疗过程中,现代医学和传统中医学均体现了各自的优势。现代医学擅长掌握疾病的诊断和病理生理过程,侧重于疾病本身,而中医的特色则是辨证论治,是对证治疗,更注重与病症相关的证候。对肝郁脾虚证的生物学基础研究有助于我们探寻其证候实质并更好地应用于临床治疗。目前中医"微观辨证"的发展为证候的研究提供了新的思路,与症状和体征等信息比较,微观指标更容易量化和标准化,一些生物标志物的研究随着科技的发展而受到了比较多的重视。这对中医辨证论治体系的完善和中西医诊断方法的结合具有重大的意义。脑-肠肽(brain-gut peptide,BGP)是一类在中枢神经系统和胃肠道表达的内分泌信号分子,通过脑-肠轴(肠-脑轴)参与摄食调节及能量平衡。Nesfatin-1作为一种新发现的抑制摄食的BGP,能够以非饱和的状态自由通过血-脑屏障。另外,nesfatin-1也被证实参与了应激反应并且与抑郁状态呈正相关。目前认为,在下丘脑内部存在着nesfatin-1-POMC/OT网络系统。下丘脑弓状核(arcuate nucleus,ARC)中的阿黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)神经元可以被外源性(来自于外周或室旁核)或者内源性(ARC自身表达)的nesfatin-1所激活,并通过黑皮质素通路或者激活室旁核(paraventricular nucleus,PVN)的催产素(oxytocin,OT)通路来起到抑食作用。这一网络系统的正常运转保证了 nesfatin-1在生理状态下对摄食的调节功能,而一旦平衡被打破,就会出现一系列的神经精神相关症状和胃肠道功能紊乱症状。本课题组前期研究表明,肝郁脾虚证模型大鼠存在着广泛的BGP水平的改变,这可能是肝郁脾虚证脑-肠互动功能发生障碍的原因之一。但nesfatin-1及nesfatin-1-POMC/OT网络与肝郁脾虚证的关系目前尚未见相关研究。逍遥散是中医用于治疗肝郁脾虚的名方,已被广泛地运用于肝郁脾虚证的相关研究中。本研究团队前期实验研究观察到,以慢性束缚21天建立应激模型,以逍遥散干预,对肝郁脾虚证起到突出的调节作用。逍遥散的作用机制可能与调节多种BGP有关。但逍遥散是否能通过调整nesfatin-1及nesfatin-1-POMC/OT网络而改善肝郁脾虚证,目前尚不明确。2 研究目的本课题通过分析脑-肠肽nesfatin-1相关信号的变化来探讨肝郁脾虚证的实质及"肝郁"与"脾虚"之间的相互作用。首先确认肝郁脾虚证模型大鼠是否存在nesfatin-1信号的变化,然后进一步分析其变化的来源及作用途径,最后分析nesfatin-1信号对摄食调节中枢下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络的影响,并观察逍遥散的调节作用。3研究方法本实验主要由四部分组成。实验一首先结合课题组前期实验研究,以21天慢性束缚应激方法复制肝郁脾虚证大鼠模型。观察模型大鼠一般状况、体重、进食量、旷场及糖水实验的行为学变化、血清D-木糖含量及外周皮质酮(corticosterone,CORT)水平,并运用以方(逍遥散)测证和以药(氟西汀)测症的方法,对肝郁脾虚证动物模型进行评价。实验二分别运用酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)法和酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法对模型大鼠外周关键的抑食因子nesfatin-1和促食因子饥饿素(ghrelin,GHRL)在血清中的含量进行检测,分析两者之间的相关性。随后观察逍遥散干预对外周nesfatin-1信号的调节作用。实验三首先筛选适合于本实验设计所用的实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术的内参基因,随后以此内参基因为参照观察各组大鼠下丘脑及胃底部的NUCB2/nesfatin-1 mRNA表达,并对下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络相关的基因表达进行检测,同时观察逍遥散的调节作用。实验四应用免疫印迹法(Western blot,WB)和/或免疫组织化学法检测各组大鼠下丘脑NUCB2/nesfatin-1、POMC、OT、以及黑皮质素受体亚型4(melanocortin recepter subtype4,MC4R)的蛋白表达水平,并使用免疫荧光双染法对nesfatin-1-POMC/OT网络相关的分子进行共定位,以探讨肝郁脾虚状态下下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络的变化及逍遥散的调节作用。4实验结果实验一:大鼠暴露于慢性束缚应激状态下逐渐出现摄食量的降低和体重增加的减缓,出现毛发枯黄、懒怠少动、大便干湿不调等外观体征状态变化;行为学研究显示:旷场实验中大鼠移动总距离和中央区停留时间降低,糖水试验中蔗糖偏好率降低;微观指标检测显示:血清D-木糖含量降低,CORT水平升高。而逍遥散组和氟西汀组则较模型组大鼠各项指标明显改善。实验二中EIA及ELISA检测显示:与正常组相比,模型组大鼠nesfatin-1在外周血清的浓度明显升高,GHRL的含量明显降低,并且各组大鼠血清nesfatin-1水平和GHRL浓度负相关,而逍遥散组大鼠则较模型组大鼠nesfatin-1水平明显下调,GHRL水平明显上调。实验三中内参基因的筛选显示,亲环素A(Peptidylprolylisomerase A/cyclophilin A,PPIA)为本实验设计中最适合用于检测下丘脑基因变化的内参基因。随后的RT-qPCR检测显示:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑NUCB2/nesfatin-1mRNA无显著变化;而下丘脑的POMC、OT和MC4R以及胃底部的NUCB2/nesfatin-1 mRNA表达均升高,与正常组比较具有统计学意义。经过逍遥散干预后,大鼠下丘脑POMC、OT和MC4R的基因表达及胃底部的NUCB2/nesfatin-1 mRNA表达均明显下调。实验四中WB检测结果与实验三中基因表达情况基本一致;免疫组化染色显示:NUCB2/nesfatin-1免疫阳性神经元在下丘脑ARC及PVN广泛分布,而POMC仅分布于ARC,OT仅分布于PVN。免疫组化半定量统计分析说明,在下丘脑ARC区,模型组大鼠POMC免疫阳性神经元阳性细胞率和平均光密度值较正常组均出现明显升高,而NUCB2/nesfatin-1则没有明显变化;在下丘脑PVN区,模型组大鼠OT和NUCB2/nesfatin-1免疫阳性神经元阳性细胞率及平均光密度值较正常组均出现明显升高,而逍遥散组与模型组相比则明显减少。免疫荧光双染结果表明,NUCB2/nesfatin-1神经元在下丘脑ARC及PVN广泛分布;POMC仅分布于ARC,OT仅分布于PVN。在ARC可见 POMC 和 NUCB2/nesfatin-1 双染神经元,在 PVN 可见 OT 和 NUCB2/nesfatin-1 双染神经元。5结论及意义实验一的模型评价结果说明本实验成功地复制了 21天慢性束缚应激肝郁脾虚证大鼠模型,此模型大鼠存在着类似于中医肝郁脾虚证的情绪抑郁(抑郁样行为)、腹胀食少(体重增长减缓和进食量降低),消化吸收能力差(D-木糖吸收能力下降),便溏不爽(大便形态改变)等变化,而运用中药复方逍遥散和治疗抑郁症的经典药物盐酸氟西汀干预后各指标的逆转也从侧面印证了模型的成功建立。实验二结果表明肝郁脾虚证大鼠模型存在着nesfatin-1和GHRL这两个作用相反而又互相制约的摄食调节因子的改变,在慢性应激状态下,外周的抑食-促食平衡被打破,而这种失衡状态对中枢神经系统的摄食调节区域的影响值得我们进一步研究。实验三结果证实下丘脑的PPIA基因在慢性束缚应激刺激、逍遥散干预、氟西汀干预的影响下稳定性最高,这为以后类似的实验中RT-qPCR检测提供了可靠的内参照。随后的RT-qPCR检测中,模型组胃底部NUCB2/nesfatin-1mRNA显著升高,说明肝郁脾虚状态下大鼠血清nesfatin-1水平的升高很可能是从胃组织表达分泌而来的。虽然模型组大鼠下丘脑NUCB2/nesfatin-1的基因表达与正常组相比无显著改变,但是下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络却被过度激活,这说明外周的nesfatin-1信号通过血液循环到达下丘脑发挥抑食作用。逍遥散干预可以不同程度地改善这种失衡状态,在调节情志变化的同时减轻胃肠道症状。实验四的WB检测进一步证实了 RT-qPCR的结果。在持续的应激下,外周的nesfatin-1表达增高可以激活下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络,这一过程可能是通过脑-肠轴实现的。通过氟西汀或逍遥散处理,可以通过降低外周nesfatin-1水平、抑制下丘脑POMC/OT网络的激活,从而起到疏肝解郁、调节食欲的作用。本研究结果提示:肝郁脾虚证模型大鼠存在着外周血清nesfatin-1浓度的升高和下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络的过度激活,通过这一信号途径,模型大鼠的进食量和体重出现了明显的降低,并且伴随着抑郁样的情绪状态。逍遥散干预后相关指标的逆转说明其可能通过调节外周nesfatin-1信号以及下丘脑nesfatin-1-POMC/OT网络从而起到疏肝解郁、调节食欲的作用。以此为切入点揭示了肝郁脾虚证脑-肠轴食欲调节失衡的机制,以及中药复方逍遥散疏肝解郁、健脾调节食欲作用的靶点和机理。