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目的:鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)是一种可引起人和禽类呼吸道感染的专性胞内寄生菌。质粒蛋白是衣原体重要的毒力因子,目前对其确切的致病机制研究较局限。本研究旨在探究Cps质粒蛋白诱导RAW264.7细胞自噬及相关信号通路,为进一步阐明Cps感染致病机制提供重要的实验依据。方法:将本课题组前期已经构建好的pET28a-CPSITp7重组菌接种至固体培养基中,选取阳性菌落扩大培养,经Ni2+NTA亲和层析柱纯化蛋白,超滤管浓缩后获得CPSITp7蛋白。经亲和层析去除内毒素后,分别用浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的CPSITp7蛋白刺激RAW264.7细胞18 h,以DPBS作为阴性对照,间接免疫荧光检测LC3荧光斑点,Western blot技术检测LC3、Beclin1、SQSTM1/p62的蛋白表达水平。用CPSITp7(10μg/mL)刺激RAW264.7细胞30 min、60 min、90 min、120 min,Western blot检测ERK、JNK、p38、Akt的磷酸化水平。CPSITp7刺激RAW 264.7细胞18 h后,RT-qPCR检测RAW264.7细胞内Toll样受体1(Toll-like receptor,TLR1)、TLR2、TLR4和TLR6的转录水平。采用TLR2 siRNA沉默RAW264.7细胞中TLR2的表达,Western blot鉴定TLR2 siRNA沉默效果;CPSITp7刺激后,Western blot以及间接免疫荧光检测细胞自噬水平。抑制ERK信号通路,CPSITp7刺激后,Western blot检测细胞自噬相关指标和ERK、JNK、p38磷酸化水平。结果:1.纯化的CPSITp7质粒蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得到与预期分子量大小一致的明显条带。2.分别用0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的CPSITp7重组蛋白刺激RAW264.7细胞18 h,Western blot结果显示:CPSITp7各浓度刺激组,LC3和Beclin1相比DPBS对照组蛋白表达水平增加,而p62蛋白表达水平则下降。并且CPSITp7(10μg/mL)刺激RAW264.7细胞18 h后,间接免疫荧光检测显示LC3荧光斑点明显增多。3.用10μg/mL的CPSITp7重组蛋白分别刺激RAW264.7细胞30 min、60 min、90 min、120 min后,Western blot分析表示:ERK、JNK、p38、Akt磷酸化水平明显增加,其中ERK、JNK和Akt磷酸化水平在刺激60 min时达到峰值,p38磷酸化水平则在120 min时达到峰值。4.质粒蛋白CPSITp7刺激RAW264.7细胞后,RT-qPCR检测结果显示:TLR2细胞内的转录水平明显增加,TLR4细胞内的转录水平略有增加,而TLR1、TLR6在细胞内的转录水平无明显变化。5.10μg/mL的CPSITp7重组蛋白刺激已转染TLR2 siRNA的RAW264.7细胞后,LC3和beclin1蛋白表达水平降低,p62蛋白表达水平相比对照组明显增加,间接免疫荧光显示LC3荧光斑点数量相比对照组减少。6.经PD98059预处理RAW264.7细胞1 h后,用10μg/mL的CPSITp7刺激RAW264.7细胞12 h,Western blot检测显示经PD98059处理的CPSITp7刺激组相比未经PD98059处理的刺激组LC3、Beclin1蛋白表达水平降低,ERK磷酸化水平降低,JNK和p38磷酸化水平未受影响。结论:重组蛋白CPSITp7刺激RAW264.7细胞后通过TLR2介导的ERK信号通路诱导自噬。