基于Rrop18-rSAG2犬弓形虫ELISA检测技术及药物筛选研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wuhu001
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弓形虫病是一种全球分布且危害严重的人畜共患病,人和几乎所有的温血动物均能感染弓形虫,成年人多为隐性感染,孕妇感染后可导致流产、弱胎或死胎。此外,该病也严重危害受孕家畜的生产,给畜牧业造成严重的经济损失。因此,建立一套科学的诊断方法和有效的治疗措施至关重要。   弓形虫表面蛋白(SAG1和SAG2)和棒状蛋白被认为是弓形虫病诊断和疫苗研究具有极大优势的两种候选分子。ROP18是弓形虫在速殖子、缓殖子都表达的蛋白,具有激酶活性的丝氨酸-苏氨酸激酶,并有免疫原性,关于其研究,目前国内外报道极少。本研究根据已知基因序列设计引物,以提取弓形虫RH株的总DNA为模板,通过PCR技术扩增rop18的主要基因,将截断的rop18基因连接到原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-rop18,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,融合蛋白以包涵体形式表达,复性后表达产物经western-blot分析,对慢性感染的血清有良好的免疫反应原性,利用重组蛋白rSAG2和rROP18,初步建立检测犬弓形虫病ELISA检测方法,对弓形虫不同时期(急性、慢性)血清中抗体均能检出,对72份犬血清进行检测,结果阳性率为12.5%,与IHA阳性符合率为85.7%,阴性符合率为95.4%。   目前弓形虫病的防治还依赖于药物,由于抗弓形虫公认有效的治疗药物的用药时间长,毒副作用较大,加上缺乏动物专用抗弓形虫药物,因此需要寻找一种高效、低毒专用于动物的抗弓形虫药物迫在眉睫,中药不但具有低毒性、低残留的优点,还可以提高动物机体免疫力和降热等疗效。为此,本研究试图筛选抗弓形虫病的中西药,利用西药快速有效的作用,结合中药清热、调节机体、低毒副的作用共同进行弓形虫病的治疗。   采用体外试验,培养Ana-1细胞作为弓形虫宿主细胞,采用MTT法测定药物对细胞的安全浓度,将弓形虫RH株速殖子与Ana-1细胞在含不同浓度药物的细胞培养液中共同培养,在加药后4,8,12,24,48小时,观察细胞和弓形虫生长状态和形态,选取48小时观察药物体外抑制虫体增殖的效果,结果发现磺胺氯丙嗪钠比磺胺嘧啶钠有更好抑制效果,甘草、百部和黄芩的可显著抑制弓形虫增殖。对拟用于抗弓形虫组方的药经KM小鼠体内抗弓形虫效果的验证,结果表明甘草、黄芩能够明显延长小鼠的存活时间,磺胺氯丙嗪钠能使50%的弓形虫小鼠存活,该药配伍黄芩和甘草两种中药形成复方药物,小鼠体内抗弓形虫试验结果提示中西药复方制剂能在保持疗效的基础上减少西药用量。   抗弓形虫药物组方磺胺氯丙嗪钠联合黄芩和甘草在人工感染40日龄上长猪体内临床抗弓形虫初步试验,表明:组方治疗猪弓形虫病后,发热症状控制较快;血液中带虫天数,血清循环抗原(CAg)峰值低于感染对照组;虫血症和血清CAg转阴速度比感染对照组快;验证磺胺氯丙嗪钠组方能有效治疗猪的弓形虫病,在推荐的使用剂量下,安全,无明显毒副作用。
其他文献
猪水肿病是常发于断奶后仔猪的一种具有致命性的肠毒血症,其病原为某些特定血清型的产志贺样毒素大肠杆菌,一经发病,病死率极高,给全球养猪业带来重大经济损失。研究发现,直