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蚕沙(Faeces bombycis)即蚕食桑叶后的排泄物,是一种传统中药。因其在治疗糖尿病,抗病毒,抗癌方面有显著的效果,引起了国内外大量学者的关注。本论文对蚕沙中的生物碱成分进行了分离纯化,并对蚕沙生物碱中的降血糖有效成分之一的1-脱氧野尻霉素(DNJ),进行了含量测定方法的研究。
首先,建立了实验室水平的蚕沙总生物碱提取工艺,利用酸水提取、离子交换、硅胶吸附等方法制备了总生物碱提取物;进一步采用HPLC分离,借助LC-MS,NMR等手段,确认了三种生物碱成分,分别为:甜菜碱,DNJ,(3R,5R)-二羟基-2(R)羟甲基哌啶(1,3-dideoxygalatonojirimycin)。其中1,3-dideoxygalatonojirimyein为一具有糖苷酶抑制活性的新化合物。
其次,对蚕沙中DNJ的含量测定进行了方法学考察,由于DNJ分子结构中缺少发色团,使对其测定方法的建立带来一定的困难。本论文采用了三种检测方法:
(1)高效液相色谱-荧光检测法:建立了FMOC-C1柱前荧光衍生测定蚕沙中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的方法。蚕沙干粉经0.05mo1/L盐酸提取,在加入FMOC-C1的乙腈溶液的条件下,DNJ反应生成荧光产物,然后用高效液相-荧光检测器测定。色谱柱:YMC-Pack ODS-A色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%冰醋酸(40:60);荧光激发光波长为254nm,检测波长:322nm;线性范围为0.008mg/ml~0.08mg/ml;重复性,稳定性及重现性RSD分别为1.66%,1.89%,1.13%;平均回收率为99.6%。实验测得蚕沙中DNJ平均含量为1.13‰。
(2)高效液相色谱-蒸发光检测法:酸水提取蚕沙中的DNJ,经无水乙醇处理,并浓缩,定容,使提取液浓度达到检测限范围,然后用高效液相蒸发光检测器测定。色谱柱Waters SCX(250mmx4.0mm,5um);流动相:水:氨水:冰乙酸=1000:0.2:0.2;蒸发光检测器参数:漂移管:50℃,气体压力:25psi,自动增益;线性范围为0.75ug-15ug;重复性,稳定性及重现性RSD分别为1.02%,0.86%,1.53%:平均回收率为98.0%。实验测得蚕沙中DNJ平均含量为1.01‰。
(3)高效液相色谱-二极管阵列检测法:蚕沙干粉经O.05mol/,盐酸提取,采用FMOC-C1作为衍生试剂,用二极管阵列检测器检测,自动扫描最大吸收波长。色谱柱Waters C18(250mmx4.0mm,5um);流动相:乙腈-0.1%冰醋酸(40:60);检测波长:206.4nm或265.4nm;线性范围为0.24ug-0.8ug;两个波长下重复性,稳定性及重现性平均RSD分别为2.16%,1.34%,1.70%;平均回收率为97.58%,RSD为2.42%。实验测得蚕沙中DNJ平均含量为1.08‰.
本论文的研究为今后深入开发蚕桑资源提供了基础,三种检测方法都能够简便、快速、准确地测定蚕沙中的DNJ含量,为DNJ的质量标准提供可靠的分析方法。