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目的:精原干细胞(Spermatogonial stem cells,精原干细胞)既可分化为成熟精子细胞,也可自我更新保持干细胞数量的稳定,对男性生育力维持有重要的作用。精原干细胞是人体内唯一可以将遗传物质传递给子代的成体干细胞,在生殖医学和再生医学有重要的应用前景。由于环境因素、不良生活方式、感染、遗传因素等交互影响,不育症已成为严重影响人类生殖与人口健康的重大疾病。在世界范围内,不孕不育约占育龄夫妇的15%,其中,由男性因素引起的不育症约占一半。非梗阻性无精子症无有效的治疗方法,其发病机制不清楚。据报道,人精原干细胞在非梗阻性无精子症(NOA)患者比梗阻性无精子症(OA)人群数目显著减少,且体外培养过程中NOA患者的精原干细胞增殖减慢,表明人精原干细胞增殖、凋亡的异常参与非梗阻性无精子症的致病机制。由于人类精原干细胞的来源有限,原代精原干细胞体外长期培养困难,人类精原干细胞自我更新调控的分子机制未见报道。因此,我们首次发现了人精原干细胞中PAK1在生长因子刺激下表达升高,并研究了PAK1在人精原干细胞的表达及其对人精原干细胞自我更新与凋亡的作用及其调控的分子机制。并且,我们比较了NOA和OA人群中的表达水平。本学位论文将为人类精原干细胞的命运决定提供新的遗传与表观遗传调控机制。方法:通过RT-PCR、Western blots、免疫细胞化学等技术对人精原干细胞系进行鉴定和纯度检测。免疫细胞化学和免疫组织化学检测PAK1在人精原干细胞系和人类生精小管的表达。生长因子处理后,我们运用real-time PCR和Western blots检测了PAK1的表达;为了确定调控PAK1表达变化的生长因子,我们培养基中添加了生长因子浓度为10 ng/ml GDNF、10 ng/ml FGF2或者10 ng/ml EGF、以及联合三种生长因子,并进行PAK1表达水平的检测。PAK1-si RNAs转染后,在RNA和蛋白水平确认敲低效果后,进行CCK8、PCNA水平、Brd U摄入、流式细胞凋亡等实验,检测PAK1对人精原干细胞系的增殖和凋亡的影响。裸鼠腹腔注射白消安,去除其睾丸组织内的生殖细胞后,进行人精原干细胞系的移植实验。移植一个月后,裸鼠睾丸组织切片,并进行PLZF、PCNA、Ki67、UCHL1等蛋白的免疫组织化学染色和TUNEL染色,在动物体内和整体水平研究PAK1对精原干细胞系的影响。Western blots检测PAK1调控人类精原干细胞的ERK1/2和AKT信号通路的改变和细胞周期蛋白的变化。免疫共沉淀检测PAK1和PDK1的相互作用。RNA-seq寻找PAK1的下游靶基因,通过生物信息学分析结合real-time PCR验证,选取具有重要生物学意义的下游基因。通过CCK8和流式细胞技术等检测PAK1的靶基因调控人精原干细胞系的生物学功能。mi RNA芯片检测PAK1敲低后非编码小RNA(mi RNA)的变化,研究PAK1调控人精原干细胞的表观遗传学机制。此外,real-time PCR、Western blots和组织芯片对NOA和OA人群中PAK1的m RNA和蛋白表达水平进行比较。本学位论文采用Graph Pad prism5.0进行数据分析,两组之间的分析采用t检验,多组数据之间的分析采用单因素方差分析(ANOVA),p<0.05认为有统计学差异显著。结果:RT-PCR、Western blots、免疫细胞化学结果显示,人精原干细胞系表达原代人精原干细胞的多种分子标记。生长因子EGF作用下,PAK1的表达水平升高,而GDNF或FGF2不改变PAK1的表达水平。PAK1敲低后,CCK8、PCNA检测、Brd U摄入和流式细胞等实验表明,PAK1可以促进人类精原干细胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。人精原干细胞系移植实验显示,在体内和整体水平,PAK1可以促进精原干细胞系增殖,抑制其凋亡发生率。RNA测序表明,PAK1敲低后,与细胞增殖密切相关的PDK1、ZNF367和KDR的表达水平显著降低。免疫共沉淀结果表明PAK1可以与PDK1相互作用;ZNF367敲低后,PDK1和KDR m RNA表达水平发生降低。PDK1-,KDR-和ZNF367-si RNAs转染后,人精原干细胞系增殖受到抑制,细胞凋亡发生率增加;另外,PAK1敲低后,我们发现phos-ERK1/2,phos-AKT和cyclin A的蛋白水平降低。芯片检测,PAK1敲低后,人精原干细胞系mi RNA表达的变化,发现mi R-31-5p显著升高,生物信息学预测其靶标,并经过mi R-31-5p mimics和inhibitor结合q PCR验证,结果表明JAZF是其主要靶标。Real-time PCR、Western blots和组织芯片结果表明,与梗阻性无精子在症人群相比,PAK1的m RNA和蛋白表达水平在非梗阻性无精子在症人群中表达降低。结论:人精原干细胞系表达原代人精原干细胞多个分子标记,该细胞系纯度好,可以用于人精原干细胞自我更新与凋亡的分子调控研究。我们发现,PAK1主要受EGF调控,而不受GDNF或FGF2的影响。PAK1可以体外促进人精原干细胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。PAK1可体内促进人精原干细胞系在白消安处理后的小鼠的生精子小管内定居、增殖,并抑制其发生凋亡。PAK1主要通过ERK1/2和AKT通路影响PDK1/KDR/ZNF367等下游基因而发挥功能,PAK1调控人精原干细胞系mi R-31-5p的表达。本学位论文揭示了PAK1在人精原干细胞系增殖与凋亡的作用与分子机制,及其在NOA患者中的异常表达,为男性不育的发生机制和人精原干细胞在转化医学中的应用提供新的遗传与表观遗传调控机制。