过表达三突变型HIF-1α重组EA.hy926细胞株的构建及鉴定

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:by_huang
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目的本研究构建过表达三突变型低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)慢病毒载体并进行慢病毒包装,感染人脐静脉内皮细胞EA.hy926,使其过表达HIF-1α,并观察HIF-1α过表达对EA.hy926细胞增殖、周期及凋亡的影响,为后续研究HIF-1α基因与其辅助激活因子的调节机制奠定坚实的基础。方法1.以原有质粒pcDNA3.1~+-HIF1-Ala402-Ala564-Ala803为模板,采用PCR扩增获取HIF-1α三突变基因片段,与pHS-BVC-B027质粒经NotI/SpeI限制性内切酶双酶切,再通过Gibson组装方法将酶切后的HIF-1α三突变基因片段与pHS-BVC-B027质粒连接形成带有目的基因片段的入门载体。通过Gateway技术中的LR结合反应,将含有HIF-1α三突变基因的入门载体与慢病毒相关的表达载体连接,构建重组三突变型HIF-1α慢病毒载体(PLV_CMV-HIF1a-2A-EGFP-2A-Puro)。慢病毒载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,经过挑选阳性克隆、摇菌、质粒提取等过程,将获得的质粒通过双酶切及测序方法鉴定载体构建是否正确。2.将重组三突变型HIF-1α慢病毒载体与慢病毒辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293T细胞,包装慢病毒,收集病毒液。3.包装好的重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞EA.hy926,含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM完全培养基筛选稳定表达HIF-1α的细胞株,在荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达情况,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)验证HIF-1α在EA.hy926细胞中的过表达情况。4.采用CCK8法检测HIF-1α过表达后细胞增殖的变化情况。5.采用流式细胞仪检测HIF-1α过表达后细胞周期及细胞凋亡的变化情况。结果1.酶切鉴定及基因测序结果都表明三突变型HIF-1α慢病毒载体(PLV_CMV-HIF1a-2A-EGFP-2A-Puro)构建成功。2.慢病毒载体与辅助包装质粒共转染HEK293T细胞48h后,成功包装出具有高效感染力的慢病毒,在荧光显微镜下观察到明显的EGFP表达。3.慢病毒感染EA.hy926细胞并经过嘌呤霉素筛选后,在荧光显微镜下观察到大量EGFP表达,感染率达到80%以上。Real-time PCR结果显示,Lenti-HIF-1α组细胞HIF-1αmRNA的表达高于Lenti-negative组及WT组,差异具有统计学意义(P<0.001)。Western blot结果显示,Lenti-HIF-1α组HIF-1α蛋白表达明显高于Lenti-negative组及WT组,差异具有统计学意义(P<0.001)。4.CCK8检测细胞增殖结果显示,细胞培养24、48、72h后,Lenti-HIF-1α组和Lenti-negative组相比,细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)。5.流式细胞仪检测细胞周期结果显示,Lenti-HIF-1α组和Lenti-negative组在G0/G1期差异无统计学意义(P>0.05),而Lenti-HIF-1α组S+G2/M期的细胞明显少于Lenti-negative组,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,Lenti-HIF-1α组细胞凋亡率明显高于Lenti-negative组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1.成功构建重组三突变型HIF-1α慢病毒载体(PLV_CMV-HIF1a-2A-EGFP-2A-Puro)。2.成功构建过表达三突变型HIF-1α重组EA.hy926细胞株。3.HIF-1α过表达在EA.hy926细胞中发挥着促凋亡的作用。
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