研究背景：既往研究表明，本研究室所建立的猪肝细胞型生物型人工肝脏支持技术（BALSS），在治疗急性肝功能衰竭模型犬和肝功能衰竭病人中取得了良好的肝功能支持作用；采用足够量的功能良好的猪肝细胞是治疗成功的关键。由于急性肝功能衰竭起病急、发展快，基层医疗单位条件难以制备高质量的猪肝细胞，因此，建立大规模猪肝细胞的低温保存方法，是BALSS临床推广应用的必要技术基础，同时可以减少治疗准备时间。目前用于治疗急性肝功能衰竭患者的冷冻保存的猪肝细胞方法是由Watanabe等建立的，虽然能够一次保存大量的肝细胞，但是该方法操作复杂，费用昂贵，难以推广。本研究目的是建立简便的可适用于临床的即取即用的肝细胞库。本研究比较了多种降温方法对中国实验用小型猪肝细胞低温保存的效果；并分别在离体培养条件下与在BALSS培养条件下，比较了新鲜分离的猪肝细胞与低温保存后复温的猪肝细胞的活率、生化功能和对药物的转化能力及形态学的差异，以建立简便可靠的大规模猪肝细胞的低温保存方法。 方法：1、用酶消化法分离小型猪肝细胞，将其随机分成三组：新鲜肝细胞组（对照组），即将新鲜猪肝细胞直接用于培养观察；其余两组分别采用梯度降温法和程控降温法进行冷冻保存。1个月后复温，先洗脱DMSO等，然后将肝细胞接种于铺有Ⅰ型胶原的培养瓶中，并在NSAL培养液中加入利多卡因、NH₄Cl及果糖，培养6h。定时取培养上清液，测定肝细胞的生化功能和药物代谢功能；并观察肝细胞的显微结构和超微结构，以筛选出最佳的低温保存条件。 2、用酶消化法分离小型猪肝细胞，将其分成新鲜肝细胞组（对照组）和梯 丫烃进修学院阶【沦文 人规模猪肝细胞低温保存力法的建)及其在生物型人工肝支持系统中的生存状态 度降温组。新鲜肝细胞直接在BALSS中培养6h，冷冻猪肝细胞先采用本研 究所建立的梯度降温方法，保存于－196OC液氮中，1个月后复温，再在BALSS 中培养6h。将新鲜或冷冻复温后的猪肝细胞置于BALSS生物反应器中，肝 细胞循环流经中空纤维管外腔；内腔经医用硅胶管与三角烧瓶相连，形成 闭合循环系统；三角烧瓶内含250ml DMEM细胞培养液；在培养液中加入利 多卡因、NH．C及果糖。定时检测肝细胞的活率、形态学变化，并取上清测 定白蛋白、尿素氮、葡萄糖、利多卡因浓度，以观察冷冻复温后猪肝细胞 在生物型人工肝系统中的生存状态。 结果：1、新鲜分离的猪肝细胞活率为81％士3．6％；梯度降温组细胞解冻后的 活率为 76．3％士 1．9％；程控降温组细胞解冻后的活率为 72．4％土 1．5％。在离体 培养同一时间点时，三组间比较其肝细胞的白蛋白与利多卡因含量无显著差 别（ryo．05）；梯度降温组与新鲜肝细胞组肝细胞的尿素及葡萄糖含量无明 显差别（ryo．05），均明显优于程控降温组（Pmpo．05）。新鲜猪肝细胞的超 微结构基本正常，小部分胞膜有小裂孔；冷冻猪肝细胞少部分破裂，存活肝 细胞胞膜完整，线粒体轻度浊肿。经培养30min后，新鲜肝细胞膜结构有所 恢复；部分冷冻肝细胞之间出现微绒毛结构，细胞器丰富，两冻存组间无明 显差别。结果表明：用两种降温方法保存的肝细胞复温后的存活率均较高， 与新鲜肝细胞相比其生化功能、利多卡因转化功能及形态学无明显差异，尤 其是梯度降温法具有简便易行、功能良好的优点。 2、新鲜猪肝细胞组在BALSS中培养的前4h活率无明显变化（ryo．05）；而 梯度降温组细胞在培养4h时的活率与oh相比即有显著下降。新鲜肝细胞与 冻存肝细胞的总蛋白、白蛋白、尿素及葡萄糖含量均随着培养时间的延长而 增加，在培养的同一时间点两组之间无显著差异（P＞0．05）。两组肝细胞利 多卡因浓度均随着培养时间的延长而下降，在培养的同一时间段，两组之间 利多卡因浓度无显著差异（ryo．05）。新鲜猪肝细胞在生物反应器中培养3h 及6h后，光镜下破裂的肝细胞数量逐渐增加，而冷冻猪肝细胞破裂的肝细胞 2 军医进修学院硕土论文 大现模猪肝细胞低温保存方法的建立及其在生物型人工肝支持系统中的生存状态 数量比新鲜肝细胞组更多，但电镜下二组存活的肝细胞均形态完整，具有丰 富的细胞器，细胞膜表面的微绒毛可见，相邻细胞聚集成团。结果表明冷冻 猪肝细胞在培养于BALSS时其生化功能、利多卡因转化功能及超微结构与新 鲜肝细胞类似。 结论：l、本研究所建立的梯度降温?