目的：　　 癫痫是多种原因造成的脑部疾病，在发达国家和地区的发病率仅次于心脑血管疾病。癫痫患者中，大约有四分之一的患者属于难治性癫痫，而在这其中约70％的患者为颞叶癫痫(TLE)。TLE是以颞叶前内侧基底部致痫灶为主引起的痫性发作，是局灶性癫痫的代表，多见于青春期或成年早期。癫痫发病机理的研究一直是神经科学研究的热点之一。但到目前为止，对癫痫的发病机理尚不十分清楚。　　 Ghrelin是1999年日本科学家Kojima等从胃中提取的一种由28个氨基酸组成的脑肠肽，第3位Ser N端辛酰基化，使其能够透过血脑屏障。Ghrelin及其受体GHSR-1α在皮层和海马也有表达。Ghrelin具有抗凋亡作用，这一作用在几种细胞类型中已经得到证实，例如主动脉内皮细胞、皮层细胞和下丘脑神经细胞等。Ghrelin对癫痫后神经元的保护作用2007年Basra等在戊四氮癫痫模型上研究过，但在体外细胞模型上还没有人研究。　　 本研究通过建立无镁细胞外液诱导的细胞癫痫模型和匹罗卡品幼鼠癫痫模型，从体内外两条途径研究神经元痫样放电后海马神经细胞损伤的凋亡状况;应用Ghrelin及其受体阻断剂干预后其受体GHSR-1αmRNA、Akt和JNK活性蛋白的表达变化;最后应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002进行干扰，研究Ghrelin抗凋亡作用通过Akt活性改变调节其下游相关凋亡的表达变化。　　 实验方法：　　 一、体外实验方法　　 1、海马神经细胞的分离、培养、纯化　　 取新生24小时的wistar大鼠冰上分离取出海马，采用胰酶消化、离心，分离出海马细胞并制成单细胞悬液种植在DMEM含血清培养基上。24小时后更换培养液，改为无血清培养液纯化海马神经细胞。　　 2、海马神经细胞免疫荧光鉴定及免疫荧光双标染色　　 取培养5天的大鼠海马神经元，经清洗、固定、山羊血清封闭，MAP-2一抗孵育过夜，二抗37℃孵育，染核，荧光显微镜照相。MAP-2和GHSR-1α免疫荧光双标染色共表达时，MAP-2与GHSR-1α一抗共孵育过夜(4℃)。　　 3、MTT法　　 取培养四天的海马神经细胞经清洗、消化，按1×106接种于96孔板内，24小时后无镁细胞外液作用3小时，加不同浓度ghrelin及其抑制剂进行干预分别到达不同时间。在中止培养前4小时，每孔加入20μl MTT孵育4小时，吸弃培养液，加入DMSO，测实验波长为560nm每孔吸光度值。　　 4、EPC-10全细胞模式膜片钳　　 模型组细胞首先暴露于无镁细胞外液中3小时，再用电压钳模式完成电极与细胞膜封接，后转向电流钳模式进行记录，采集电流信号经放大器放大，由PULSE软件进行数据采集和记录。　　 5、流式细胞术　　 消化实验各组海马神经细胞，经离心、清洗、PBS洗后加入1000μg/L碘化丙锭500μL，4℃避光放置30分钟，流式细胞仪上样检测，CellQuest3.0采集细胞，MedFitLT3.0软件分析细胞凋亡数。　　 6、Real-time PCR分析　　 常规清洗、消化收获待测细胞于—80℃保存备用。所有器皿应用0.1％ DEPC溶液处理;加入Trizol超声振荡致细胞裂解，然后Trizol法进行RNA抽提。用紫外分光光度计测出A260及A280的值，计算所提总RNA的含量。逆转录后，将各组反应体系包括待测的GHSR-1α引物和待测RNA依次加入PCR反应用毛细管，轻轻离心后放入Light Cycler PCR仪中进行Real Time PCR反应，定量、分析。　　 7、Westem blot　　 取细胞经胰酶消化、离心、洗涤三遍，收集细胞沉淀;酚试剂法进行蛋白定量，各组取等量蛋白，聚丙酰胺凝胶电泳分离，并转至PVDF膜上。脱脂奶粉溶液封闭，一抗孵育过夜，二抗常温下孵育2小时。后进行显色、曝光、定量分析。加待测Akt和p-Akt、JNK和p-JNK以及凋亡部分相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cyt-c的一抗和相匹配的二抗。　　 二、体内实验方法　　 1、匹罗卡品幼鼠癫痫模型的建立　　 模型组Wistar幼鼠经腹腔注射匹罗卡品。对照组大鼠注射等量的生理盐水。动物于注射匹罗卡品前半小时预先腹腔注射阿托品以阻滞外周胆碱能反应。大鼠在注射匹罗卡品后观察其行为学变化，实验动物痫性发作等级评价标准采用Racine（1972年）分级标准。　　 2、EEG记录　　 腹腔注射匹罗卡品30分钟后麻醉动物，脑立体定位仪固定大鼠，与前囟点(Bregma)向后X=2.30mm，矢状缝（sagittal suture）旁Y=2.10mm，硬膜下Z=2.0mm定位海马，钻孔后电极自动达定位点，观察并记录实验动物海马EEG波形。　　 3、免疫荧光双标染色　　 过量麻醉处死动物，迅速取出大脑，放入液氮中冷却，然后用冰冻切片机制备5μm厚的冠状冰冻切片。4％多聚甲醛固定，MAP-2与Ghrelin一抗共孵育过夜(4℃)，二抗37℃孵育、染核，荧光显微镜照相。　　 4、TUNEL染色　　 实验动物麻醉后，常规灌注、固定、取材、切片。切片浸入3％H202 PBS液5分钟，滴加血清封闭，滴加反应液20μl，切片置于湿盒内(37℃)2小时，PBS清洗后滴加反应终止液(RT)，加抗地高辛过氧化物酶抗体，最后DAB显色，光镜下观察，并进行海马CA1、CA3的TUNEL阳性细胞计数。　　 5、Real-time PCR GHSR-1αm RNA分析　　 过量麻醉处死动物，迅速取大脑并剥离海马，放入DEPC水处理过的EP管内。余步骤与体外实验方法相同。加GHSR-1α引物与待测RNA。　　 6、Westm blot检测GHSR-1α、Akt、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cyt-c蛋白表达　　 过量麻醉处死动物，迅速取大脑并剥离海马，样品剪碎后加入裂解液4℃1小时，离心、取上清。余步骤与体外实验方法相同。加待测Akt和p-Akt、JNK和p-JNK以及凋亡部分相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cyt-c的一抗和相匹配的二抗。　　 结果：　　 一、体外实验结果　　 1、海马神经细胞形态学观察　　 刚接种的神经元呈圆形、体积小、透亮、单个均匀分布;6小时细胞开始贴壁;第2天更换无血清培养基，细胞胞体呈梭形或锥形，带有突起的细胞数增多，背景中有少量扁平状多边形的神经胶质细胞;第5天神经元突起密集联结成网，神经元胞体继续增大，背景中无扁平状多边形的神经胶质细胞。　　 2、海马神经元的鉴定以及免疫荧光双标染色共表达　　 MAP-2绿色荧光染色阳性反应在海马神经元胞体及突起出现;标记绿色荧光的MAP-2海马神经元在红色激发光激发的荧光下，可见标记红色荧光的GHSR-1α蛋白表达，GHSR-1α蛋白主要表达在胞体。　　 3、 MTT海马神经细胞活力分析　　 MTT结果示Mg2+-free损伤后OD值逐渐下降(P＜0.05); Ghrelin浓度增加，海马神经细胞OD值逐渐升高(P＜0.05); Mg2+-free损伤后3天海马神经细胞OD值逐渐下降明显(P＜0.05)。　　 4、全细胞模式的膜片钳记录　　 致痫前海马神经细胞可以记录到自发性突触后电位。由正常细胞外液换成无镁细胞外液作用2小时后，海马神经细胞出现自发的反复癫痫样电，呈惊厥样电活动(P＜0.05)。　　 5、流式细胞仪检测海马神经元体外培养异常放电后凋亡细胞数　　 培养的海马神经元在Mg2+-free作用下6小时后就有凋亡细胞产生，随着时间的延长凋亡细胞数逐渐增加(P＜0.05)，用Ghrelin10-7mol/L干预Mg2+-free作用的3小时的神经元后，凋亡细胞数较Mg2+-free作用3天组明显减少(P＜0.05)，而D-Lys3-GHRP-6阻滞了这一作用。　　 二、体内实验结果　　 1、匹罗卡品幼鼠癫痫模型行为学观察　　 实验动物腹腔注射匹罗卡品后，经历5～30分钟的潜伏期，约53％的实验动物经多次Ⅲ级以上发作后，进入不能自行停止的持续发作状态，即SE。实验动物进入SE的时间约为15～35分钟。约52.3％的实验动物被诱发出SE。　　 2、 EEG观测结果　　 对照组实验动物麻醉状态下记录到的EEG以低幅α，β3波为主，背景活动较低。潜伏期，模型组动物EEG记录到单个中等波幅的尖波。实验动物开始痫性发作时，EEG显示为爆发的锋电位丛，表现为有规律的、节律大致一致的尖/棘波群。　　 3、TUNEL染色结果　　 对照组实验动物海马CA1区和CA3区TUNEL阳性反应细胞很少。SE后3天，TUNEL阳性细胞数量在模型组动物较对照组明显增多(P＜0.05)。Ghrelin干预后凋亡细胞数较pilo组和pilo+NS组明显减少(P＜0.05)，Ghrelin和D-Lys3-GHRP-6共同作用后，TUNEL阳性细胞数较Ghrelin组增多(P＜0.05)。　　 三、体外、体内实时定量RT-PCR结果　　 应用为实时定量PCR设计的引物检测培养的海马神经元和匹罗卡品幼鼠癫痫模型海马组织神经元异常放电后， GHSR-1αmRNA的表达明显降低。用Ghrelin干预后，GHSR-1αmRNA的表达显著增加;用Ghrelin+D-Lys3-GHRP-6共同干预后，GHSR-1αmRNA的表达与Ghrelin干预组相比明显降低(P＜0.05)。　　 四、体外、体内Western blot结果　　 1、p-Akt和Akt、p-JNK1/2和JNK1/2　　 应用p-Akt和Akt抗体检测，约在56KD处可见特异性染色条带，模型组海马细胞和海马组织p-Akt蛋白表达含量逐渐降低，给予Ghrelin干预后，它的表达量较模型3天组显著升高(P＜0.05)，应用Ghrelin+ D-Lys3-GHRP-6共同干预后，p-Akt蛋白表达量较Ghrelin干预组低。应用p-JNK抗体检测，约在46KD、54KD处可见特异性染色条带，模型组海马细胞和海马组织p-JNK1/2蛋白表达量逐渐增加，给予Ghrelin干预后，它的表达量较模型3天组显著降低(P＜0.05)。用Ghrelin+D-Lys3-GHRP-6干预后，p-JNK1/2蛋白量较Ghrelin组增加(P＜0.05)。　　 3、bcl-2、Bax、Caspase-3和Cyt-c　　 Mg+2-free组和pilo组海马神经元在痫样放电后，Bax的表达较对照组逐渐增多;Ghrelin干预后与模型组和盐水干预组相比Bax的表达显著降低(P＜0.05);进一步用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，Bax的表达较Ghrelin组显著增加(P＜0.05)。Bcl-2的表达与对照组相比逐渐降低(P＜0.05); Ghrelin干预后与模型组相比显著增强了Bcl-2的表达(P＜0.05);进一步用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，Bcl-2的表达较Ghrelin干预组显著降低(P＜0.05)。Caspase-3从12小时开始显著增强，至3天时达到高峰，Ghrelin干预后与模型组比较显著降低了Caspase-3的表达(P＜0.05)，进一步PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，Caspase-3的表达较Ghrelin干预组显著增加(P＜0.05)。Cyt-c的表达SE后逐渐增多，Ghrelin干预后模型组相比显著降低了Cyt-c的表达，(P＜0.05)，进一步用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，Cayt-c的表达较Ghrelin干预组显著增加(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、Ghrelin的受体GHSR-1α在海马神经细胞上表达。　　 2、Ghrelin可以减少海马神经细胞的凋亡数，促进细胞增殖。　　 3、Ghrelin增加体外培养的海马神经细胞癫痫模型中细胞活力。　　 4、Ghrelin增强体内、体外癫痫模型海马神经细胞的p-Akt的表达，降低了p-JNK的表达;其作用是通过其受体GHSR-1α介导的。　　 5、在体内、体外癫痫模型中，Ghrelin可以增强Bcl-2和降低Bax、caspase-3和Cyt-c的表达，其调节作用是通过激活p-Akt实现的。