最近一些年来，已有数个被自身CTL所识别的肿瘤抗原基因被发现，许多由这些肿瘤抗原基因编码的HLA-Ⅰ类分子限制性CTL表位也被相继证实。在这些肿瘤抗原基因中，黑色素瘤抗原(melanoma antigen, MAGE)基因已被证实在许多肿瘤组织中均有表达，而在正常组织中除睾丸外未见表达。MAGE-n为我室首次报道的MAGE家族基因的新成员(GENEBANK登录号AF443295)，它与MAGE-A家族基因有较高的同源性且与肝细胞癌(HCC)关系密切。 肝细胞癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一，对肝细胞癌的治疗尽管已取得一些进展，但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想，免疫治疗目前虽主要作为临床治疗辅助手段，但被认为是最有希望的治疗手段。由于中国HCC患者中HLA-A2比例较高，因此研究HLA-A2限制性的MAGE-n抗原表位以诱导针对HCC细胞的特异性CTL具有十分重要的意义。 在本研究中，我们应用表位预测结合表位重建的方法筛选MAGE-n HLA-A2限制性CTL表位，以筛选到的表位在荷人肝癌SCID小鼠，进行抑瘤实验。结果证实，表位QLVFGIEVV(MAGE-n 159～167)与HLA-A2分子具有高亲和力，同时可从健康HLA-A2供体外周血单个核细胞 （PBMC）诱导特异性 CTL，该 CTL可特异性杀伤表达 MAGE－n的HLA．AZ阳性HCC细胞系，SCID小鼠移植瘤预防及治疗实验显示该表位可在体内产生特异性抗肝癌免疫效应。全文分为以下三个部分：第一韶分：来位预测目的 预测＊＊＊rn抗原的一般生物学特性及＊＊介AZ限制牲＊＊L表位。方法 用SYFPEITHI超基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法，筛选新的MAGE－n抗原HLA－AZ限制性CTL表位作为侯选表位。应用 ANTHEPROT VS刀软件预测 MAGE－n编码蛋臼的一般生物学特性。结果 用表位预测法筛选MAGE七抗原5个HLA－AZ限制性CTL表位（九肽）为侯选表位。MAGE－n抗原的疏水性、亲水性、抗原性、跨膜结构域、等电点及信号肽潜在切割位点同时被预测分析。结论SYFPEITHI超基序法和量化基序多项式法结合的预测方法可提高表位预测的效率及准确性。第二袂分：预测表位的免疫学特性目的 用表位重建技术、ELISPOT及特异性杀伤实验研究HLA－AZ限制性CTL候选表位的结合力及兔疫活性。方洁 对预测的抗原表位进行固相合成，并用HPLC进行纯化，质谱法（MS）鉴定。侯选表位与HLA－AZ位点的亲和力及结合稳定性用竞争结合抑制实验、TZ结合稳定性实验及MHC－肽复合体稳定性实验测定。RT－PCR法检测HCC细胞系MAGE－n表达。脂质体转染法构建MAGE0基因转染细胞系。应用ELISPOT技术检测抗原肽特异性释放IFN＊的T细胞频数。从HLA－AZ阳性健康志愿者外周血分离单个核细胞0BMC），用TZ细胞负载MAGE0抗原肽反复刺激活化 （每周1次，共4次）诱导抗原肽特异性CTL。乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定诱导CTL对表达MAGE0的HLA－AZ阳性HCC细胞的识别及杀伤效 一3一应。结果QLVFGIEVV（159－167），IW盯GFLI（195－203）和FLllVLVMI（20上09）三个表位具有较高的HLA－A二结合力（IC50司卜M）和结合稳定性＊T50＞6h卜 本研究所用HCC细胞株均为HLA－AZ阳性，其中HHCC、BEL7402呈MAGE－n表达阳性。TZ负载MAGE－n／ HLA－AZ抗原肽QLVFGIEVV、FLllVLVMI禾TZ负载Flu／ HLA－AZ抗原肽刺激组释放IFNry效应细胞斑点数平均为167土13．85门’细胞、154士9．65／105细胞及172土15／10’细胞，明显高于单纯TZ刺激组（41 i6／10’细胞）（＜0．05）。22天诱导培养后，效应细胞中CD3＊细胞比例增加到88％，CDS”T细胞比例增加到84O。MAGE－n抗原肽QLVFGIEVV诱导CTL可特异性杀伤表达MAGE．n HLA．AZ阳性细胞系，同时这种特异性杀伤效应可被抗HLA－AZ分子抗体所阻断。结论 本研究证实表位重建技术结合免疫学方法 （ELISPOT，LDH细胞毒实验）可提高表位研究的效率和准确性。实验筛选出的MAGE0抗原表位QLVFGIEVV可作为特异性免疫治疗的靶分子而应用于HLA．AZ阳性肝癌患者免疫治疗。第三部分：荷人肝癌SCID小巨抑回实验目的 研究 MAGE0抗原表位 QLVFGIEVV特异性 CTL对荷人肝癌SCID ’J＼鼠的抑瘤作用。方洁 用 HHCC mLA－AZ”，MAGEfl、细胞皮下接种建立 SCID小鼠荷瘤模型。用 TZ细胞负载抗原肽 QLVFGIEVV反复刺激活化从HLA－AZ阳性健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）诱导抗原肽特异性CTL。动物随机分为3组，分别注射对照培养基（对照组）、CTL（预防组，于接种肝癌细胞前）和 CTL（治疗组，于接种肝癌细胞后）。CTL细胞分别由尾静脉及腹腔注射，每次输注 2．5 XIO乙于接种肿瘤细胞42天测定SCID小鼠脾脏细胞人CD分型。观察各组成瘤率、生长速度、肿瘤体积及重量、肺及其他重要脏器的转移等指标。结果表型分析显示CTL输注动物肿瘤接种42天后脾脏细胞中人CD3”T细胞约 一4?