论文部分内容阅读
玉米是世界重要粮食作物，其产量的高低在国民经济的发展中起着重要的作用。玉米产量和品质受多种环境胁迫和生物胁迫的影响。玉米的倒伏是严重影响玉米生产的限制因素，分离矮化基因并研究其功能具有重要的理论实践意义。除此之外，玉米的生长发育还受微生物感染、合成或降解途径的基因突变，甚至细胞程序性死亡等很多因素影响，分离坏死基因并研究其功能也具有重要的理论意义。本文对矮秆突变体和坏死突变体的表型、候选基因和功能做了分析，结果如下:1.矮秆突变体属GA缺陷型矮化突变体：矮秆突变体株高较矮只有高秆株高的49.57%，节间均匀缩短，结实正常，种子变小，生育期与高秆相比略有推迟。扫描电镜观察表明矮化是由节间纵向细胞的伸长受阻引起的。通过不同浓度外源激素GA、BR和IAA处理，结果发现外源GA能促进突变体第二叶鞘的伸长，有效回复矮化的表型；外源BR在黑暗或是光照下均不能回复矮化的表型；外源生长素IAA也不能促使突变体第二叶鞘的伸长。据此，我们认为矮化突变体是一个GA缺陷型矮化突变体。2.矮化突变候选基因Dt的克隆分析与确定：前期的定位结果将Dt基因定位在分子标记187790-4与c187790-15之间物理距离68Kb的区间，对区间的基因分析找到3个开放阅读框（ORF）：GRMZM2G040359（植物脂肪酸水解酶）、GRMZM2G040673（植物特异TIGR01568蛋白家族）、GRMZM2G016477（油菜素类固醇不敏感受体激酶BAK1前体）。对三个基因cDNA和DNA测序分析，发现突变体中基因GRMZM2G040673的第663个碱基发生突变，导致蛋白质第221个氨基酸由赖氨酸突变为甲硫氨酸。8个玉米自交系的测序结果进一步验证了该基因的特异点突变，初步确定GRMZM2G040673为矮秆候选基因Dt。Dt基因组序列全长1720bp，编码383个氨基酸。Dt蛋白是一个含高度保守OVATE结构域的转录因子蛋白家族。3.矮秆基因Dt的时空表达分析：半定量RT-PCR和Real-time PCR结果发现Dt基因在根、茎、叶、雄穗、雌穗中都有表达，在茎和雌、雄穗中的表达量较高，矮秆突变体中Dt基因的表达与自交系P11中没有明显差异；RNA原位杂交结果表明Dt基因的表达信号遍布整个分生组织区，顶端分生区中心信号最强，表达水平最高，与突变体中Dt基因表达差异不明显。4.矮秆基因Dt的功能验证：OVATE基因是植物特有的一类转录抑制因子。Dt-GFP融合蛋白转染洋葱表皮细胞的亚细胞定位结果显示Dt蛋白定位于细胞核内，是转录因子蛋白。通过构建RNAi、过表达载体和功能互补载体转化玉米验证Dt基因功能，结果显示Dt基因干扰后，功能改变，出现矮化表型；Dt基因过表达和互补载体转化玉米，得到T0代转基因植株，表型有待于鉴定。通过对突变体中GA合成代谢途径中一些关键酶基因的表达分析，发现突变体中与GA合成相关的基因ZmKS的表达量降低，推测ZmKS是Dt基因的靶基因。5.黄化坏死突变基因nec-t的鉴定：黄化坏死叶突变体nec-t两叶期表现黄化，叶绿素含量降低，有坏死斑点，并在正常光照下死亡。透射电镜结果表明：突变体nec-t中类囊体分散，基粒片层减少，叶绿体数目也减少。前期将nec-t基因定位131.7Kb的区间内，有4个开放阅读框（ORF）：LOC100274241、LOC100280469、AC215678.3和LOC100192977。测序发现突变体中基因LOC100192977的5′非翻译区有7bp的插入突变。初步确定LOC100192977为黄化坏死基因的候选基因nec-t。该基因在玉米叶片中表达量最高，在根和茎中也有表达，但表达量相比叶片中的要弱很多，几乎检测不到；突变体中该基因的表达相比B73有所降低。nec-t基因编码的甲硫氨酸氨肽酶，负责切除新生肽链N端的起始甲硫氨酸，对叶绿体的定位和功能调节极其重要。