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本研究在已有研究的基础上，首先探讨Apelin在胃癌中的表达及其在胃癌发生、发展、预后中的作用;然后，探讨Apelin对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制;最后通过体内实验进一步明确Apelin表达对胃癌增殖的影响及其和血管形成的关系。旨在为Apelin作为胃癌的预后指标、分子靶向治疗潜在靶点奠定研究基础。 第一部分 Apelin在胃癌组织中的表达及其临床意义 目的： 明确胃癌组织中Apelin、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达水平，分析Apelin、VEGF表达与微血管密度(microvessel density,MVD)的相关性。分析Apelin、VEGF的表达水平与患者临床病理因素及预后的关系。 方法： 1.回顾性分析2009年1月至2011年12月滨医附院接受胃癌根治术(D2且R0）并完成术后辅助治疗的胃癌患者178例。收集178对癌组织及癌旁组织。 2.利用免疫组织化学技术Envision法检测Apelin、VEGF蛋白在胃癌组织及对应的癌旁组织中的表达水平。分别根据Apelin、VEGF表达水平分为阳性表达组和阴性表达组。CD34标记用于计算MVD。 结果： 1.Apelin呈现胞浆内弥漫性表达，癌组织阳性率高于癌旁组织(49.44％vs29.78％，P＜0.01)。VEGF在胃癌组织中也为胞浆表达，癌组织阳性率高于癌旁组织（55.62％vs39.89％，P＜0.01）。 2.Apelin表达与脉管侵犯、N分期、T分期、病理类型、神经侵犯相关(P＜0.05)，与性别、年龄、发病部位无关(P＞0.05);VEGF表达与T分期、脉管侵犯、N分期相关(P＜0.05)，与性别、年龄、发病部位、病理类型、神经侵犯无关(P＞0.05)。 3.Apelin阳性组MVD为33.086±7.862，Apelin阴性组MVD为21.071±6.320，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。VEGF阳性组MVD为29.075±8.193，VEGF阴性组MVD为19.638±5.614，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。 4.Apelin与VEGF蛋白在胃癌组织表达呈正相关性(rs=0.856，P＜0.01)。 结论： Apelin在胃癌组织中表达高于癌旁组织，其表达与脉管侵犯、淋巴结转移、T分期、VEGF表达、MVD等情况相关。Apelin可能通过促进血管形成参与了胃癌的生长及转移，从而导致患者预后差。 第二部分 Apelin表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制 目的： 明确胃癌细胞系中Apelin表达情况。探讨Apelin表达水平对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制。 方法： 1.培养胃癌细胞系MGC-803、SGC-7901、HGC-27。 2.应用实时定量反转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real time RT-PCR)、免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测细胞中Apelin mRNA、Apelin蛋白、Apelin分泌蛋白的水平。 3.构建pcDNA3.1-Apelin，脂质体瞬时转染胃癌细胞系MGC-803。 4.应用MTT、Transwell实验、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分别检测Apelin基因过表达前后、Apelin-13（Apelin的主要亚型）诱导前后细胞的增殖、侵袭及凋亡情况。 5.Western blot法检Apelin过表达前后、Apelin-13诱导前后MGC-803细胞系中pERK、pAKT、细胞周期蛋白D1(CyclinDl)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表达。 结果： 1.Apelin mRNA在MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞系中相对表达水平分别为1.000±0.344、14.596±2.928、29.755±5.067。三者之间表达水平差异均有统计学意义(P＜0.05)。 2.Apelin蛋白在MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞系中相对表达水平分别为0.150±0.067，0.420±0.102，0.873±0.114。三者之间Apelin蛋白表达水平差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.在MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞系上清液中Apelin分泌水平分别为132.00±31.97pg/ml，492.33±64.21pg/m1，761.00±45.52pg/ml。三者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。 4.应用基因克隆技术成功构建Apelin基因真核表达载体pcDNA3.1-Apelin并转染胃癌细胞系MGC-803。 5.Apelin-13诱导促进胃癌细胞MGC-803增殖，2.5μmol/L为最佳作用浓度，诱导后细胞增殖能力差异从12h开始，持续至48h。 6.Apelin过表达促进MGC-803增殖，细胞增殖能力差异从24h开始，持续至48h。 7.未处理细胞、Apelin-13诱导细胞穿膜细胞数分别为102.00±24.59、406.33±37.62，两者差异有统计学意义(P＜0.01)。pcDNA3.1转染细胞、pcDNA3.1-Apelin转染细胞穿膜细胞数分别为111.00±33.30、302.33±47.23，两者差异有统计学意义(P＜0.01)。 结论： 1.胃腺癌细胞系MGC-803、HGC-27、SGC-7901中Apelin表达水平有差异，MGC-803中Apelin mRNA、蛋白、分泌蛋白在三个细胞系中均为最低。 2.Apelin过表达、Apelin-13诱导促进胃癌细胞系MGC-803细胞增殖、侵袭。 3.SAHA可以诱导胃腺癌细胞系MGC-803细胞凋亡，但Apelin过表达、Apelin-13诱导在该过程中未引起凋亡抵抗。 4.Apelin可能通过激活MAPK/ERK信号通路上调Cyclin D1、MMP-9的表达从而发挥其作用。 第三部分 Apelin过表达对胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及其与血管生成的关系 目的： 明确Apelin过表达对胃癌裸鼠皮下瘤生长的影响并探讨其和血管生成的关系。 方法： 1.通过慢病毒介导及嘌呤霉素筛选建立pLV-puro-Apelin稳定转染MGC-803细胞系及pLV-puro-NC稳定转染MGC-803细胞系; 2.应用pLV-puro-Apelin稳定转染MGC-803细胞及pLV-puro-NC稳定转染MGC-803细胞建立胃癌皮下移植瘤模型; 3.对比观察两组胃癌皮下移植瘤生长情况，绘制体积生长曲线; 4.杀鼠取瘤后测量皮下移植瘤重量，计算增殖率; 5.CD34标记，免疫组化Envision法检测裸鼠皮下瘤内MVD。 结果： 1.成功建立pLV-puro-Apelin稳定转染MGC-803细胞系及pLV-puro-NC稳定转染MGC-803细胞系。 2.14只裸鼠随机分为对照组及Apelin过表达组，分别接种pLV-puro-NC-MGC-803及pLV-puro-Apelin-MGC-803细胞。对照组及Apelin过表达组各有6只裸鼠成瘤，成瘤率85.7％。成瘤裸鼠观察至24天，过表达组部分裸鼠出现活动减少，进食差等情况，随终止观察。 3.7、10、14、17、20、24天对照组、Apelin过表达组裸鼠皮下移植瘤体积(mm3)分别为22.656±8.702vs26.775±11.745(P＞0.05)、61.517±23.151vs80.836±26.352(P＞0.05)、106.115±36.515vs196.010±66.854(P＜0.05)、306.789±105.315vs567.346±198.854（P＜0.05）、748.919±214.059vs1399.063±499.872(P＜0.05)、1367.348±444.701vs2557.645±684.409(P＜0.01)。 4.对照组皮下瘤重量为1.70±0.43g，Apelin过表达组皮下瘤重量为2.96±0.61g，两组间差异有统计学意义(P＜0.01)。皮下瘤增殖率为42.5％。 5.Apelin过表达MGC-803细胞裸鼠皮下移植瘤内MVD为168.833±35.078;对照细胞裸鼠皮下移植瘤MVD为112.333±29.859。两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论： Apelin过表达可以促进胃癌裸鼠皮下移植瘤增殖，这或许和其促进胃癌裸鼠皮下瘤内MVD增加有关。