猪Follistatin基因克隆与表达的研究

来源 :中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:konashu
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Follistatin(FS)-卵泡抑制素是一种分泌型蛋白。在最初的研究中,人们认为FS仅在垂体中调控卵泡刺激素FSH(Follicle-stimulatinghormone)的分泌。随后的研究发现:成年动物体内的FS与动物的生殖功能有关。最近的研究表明:FS对动物的早期胚胎发育有着很重要的作用。在FS基因敲除小鼠的研究中发现:由于肌肉发育不全以及骨骼异常而致使小鼠出生后死亡。 本研究首先通过LD-PCR方法,获得了猪FS的完整基因序列,全长5.3kb。随后,提取猪卵巢总RNA,经RT-PCR方法,克隆了猪FScDNA的完整开放阅读框,其长度为1038bp。将FScDNA克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了GST-FS融合蛋白的表达,经IPTG诱导培养,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western杂交检测,结果显示在63kD处有特异性表达蛋白,其具有免疫活性。 为进行FS在哺乳动物细胞中的表达,构建了FScDNA的真核表达质粒pPSKA-FS,它以pGl-basic为原始载体,用猪骨骼肌a-actin启动子取代FS原有启动子,目的是使FScDNA能在骨骼肌中特异性表达增强。将pPSKA-FS进行猪骨胳肌细胞转染,经SouthernBlot/WesternBlot和细胞MTT实验,结果表明:FS的表达可使肌细胞数量增多;单个肌细胞体积增大。 为进行转基因动物的研究,基于以往的研究-精子介导的外源基因转导法,建立了全新的制备转基因动物新方法-睾丸注射法。将外源DNA与脂质体形成复合物后,注射到雄性性成熟ICR小鼠的睾丸中,并在其中形成含外源DNA的精子;上述雄性动物与雌性小鼠自然交配,制备转基因动物。F1代转基因阳性率为41%,经Southern杂交表明外源基因已整合到寄主的染色体上。经传代,F2转基因阳性率为37%。通过上述实验证明:睾丸注射法可将外源基因转移,并产生转基因动物,而且可遗传给后代。 利用上述转基因新方法,进行FS转基因小鼠的研究。将已构建的真核表达质粒pPSKA-FS进行ICR小鼠的睾丸注射,经自然交配获得FS转基因小鼠。以PCR,Southern杂交法进行外源基因的检测。转基因阳性小鼠的体重高于野生型小鼠,剖检结果显示:阳性个体的肌肉块大于野生型个体,并具有全身肌肉增生症状且脂肪减少。结果表明:FS是一种肌肉生长的正调控因子,当外源FS基因在体内表达时可促进阳性个体的肌肉增生。 通过本研究表明:猪Fo11istatin基因的表达,可使动物产生增肌效应。FS的增肌效应表现为;肌肉数量增多(肌肉纤维数量增多);质量肥大(肌肉纤维增粗)。FS的增肌效应并非病态的肌肉增生,对于其他的组织与器官无有害影响,这对畜牧业提高家畜的肉用性状有实用意义。
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