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研究背景: 目前治疗慢性粒细胞白血病药物以酪氨酸激酶抑制剂为主,因尚存在价格昂贵、耐药、骨髓抑制效应及患者体内白血病干细胞存留容易导致白血病复发等缺点,影响了临床应用。槐属植物中药含有喹诺里西啶类生物碱,体外实验证明具有抑制白血病细胞增殖,诱导凋亡、自噬及分化等抗白血病效应,具有临床治疗慢粒白血病应用前景,具体分子机制尚不清楚。 研究目的: 通过喹诺里西啶类生物碱对慢性粒细胞白血病K562细胞株增殖抑制效应检测,以及诱导K562细胞自噬、分化分子机制的研究,探讨喹诺里西啶类生物碱对慢粒白血病治疗的临床应用价值。 实验方法: 1.槐属植物中药苦参及喹诺里西啶类生物碱作用K562细胞, MTT法检测不同药物浓度和处理时间对细胞增殖抑制作用,并计算IC50,以评估K562细胞对各药物敏感程度,并为喹诺里西啶类生物碱诱导K562细胞自噬及分化机制的研究提供浓度选择依据; 2.吖啶橙染色法观察不同类型喹诺里西啶类生物碱诱导K562细胞自噬现象,并计数200个细胞计算吖啶橙染色阳性率;以苦参碱作用K562细胞吖啶橙染色阳性率与细胞增殖抑制率进行相关性分析,探讨自噬与增殖抑制相关性。Western blotting检测苦参碱诱导K562细胞自噬标志蛋白LC3的剪切现象,在分子水平进一步确认自噬发生; 3.苦参碱联合ClassⅢ/PI3K途径及mTOR途径抑制剂作用K562细胞48小时,吖啶橙染色及Western blotting观察细胞自噬抑制现象,以探究苦参碱诱导K562细胞自噬途径; 4.联苯胺染色法观察喹诺里西啶类生物碱诱导K562细胞红系分化效应,并计数200个细胞计算联苯胺阳性率;将联苯胺染色阳性率与细胞增殖抑制率进行相关性分析,探讨苦参碱诱导K562细胞红系分化与增值抑制相关性。RT-PCR技术检测红系分化指标γ-globin及GPA基因表达情况,在mRNA水平进一步确认苦参碱诱导K562细胞分化事件发生。 5.苦参碱诱导K562细胞5天,Western blotting检测PARP、LC3蛋白剪切;RT-PCR检测Bim、Beclin1、Mcl-1、 Gfi-1B、Fli-1、p21、cyclinD1等基因表达的改变,探讨苦参碱诱导K562细胞分化的作用机制。 结果: 1.苦参及喹诺里西啶类生物碱可引起K562细胞量效时效的增殖抑制作用; 2.喹诺里西啶类生物碱可引起白血病K562细胞量效时效自噬作用,苦参碱诱导K562细胞自噬作用可被ClassⅢ/PI3K途径抑制剂部份阻断; 3.苦参碱可诱导K562细胞红系分化; 4.苦参碱诱导K562细胞红系分化的剂量未引发PARP、LC3蛋白剪切;不改变Bim、Beclin1、Bcl-xL、cyclinD1等基因mRNA表达水平,但可引起Mcl-1、Fli-1基因mRNA表达水平表达下调,Gfi-1B、p21基因mRNA水平表达上调。 结论: 1.喹诺里西啶类生物碱可抑制白血病K562细胞增殖; 2.苦参碱可通过ClassⅢ/PI3K途径诱导K562细胞自噬,且自噬与增殖抑制呈正相关; 3.0.4mM苦参碱可诱导K562细胞红系分化,未引起凋亡、自噬。