细胞遗传学研究显示,大约40﹪的M2型急性髓性白血病(AML)病人存在t(8;21)染色体易位.该易位导致21号染色体上的.AML1基因和8号染色体上的ETO基因融合,表达AML1-ETO融合蛋白.其中,野生型AML1属于转录因子,在造血细胞的分化发育中发挥重要作用,而ETO蛋白主要通过结合共抑制因子,并募集组蛋白去乙酰化酶,发挥转录抑制功能.体外研究表明,AML1-ETO能显性负抑制野生型AML1的转录激活作用,干扰造血细胞的正常分化,促使白血病的发生.但是,各种转基因小鼠实验显示,仅有AML1-ETO的表达并不能诱发AML,AML1-ETO相关的白血病的发生可能还需要其它遗传学改变的参与.另一方面,研究显示,除了抑制造血细胞分化外,AML1-ETO蛋白也参与细胞增殖和细胞凋亡过程. 本课题利用可诱导表达.AML1-ETO的U937白血病细胞系-U937-A/E细胞,观察AML1-ETO诱导表达对细胞凋亡的影响.结果发现,AML1-ETO融合蛋白表达后,在各种凋亡诱导剂(包括通过内源性和/或外源性细胞凋亡信号途径诱导细胞凋亡的激活型Fas抗体、紫外线和新型喜树碱衍生物NSC606985等)的作用下,U937-A/E细胞发生凋亡的敏感性显著增加,并且凋亡过程中caspase-8、caspase-3的活化增强.同时,AML1-ETO可分别在转录和转录后水平上调凋亡相关基因Bak和Fas受体的表达.考虑到AML1-ETO的促凋亡作用并不支持白血病的发生,我们推测体内白血病的发生必定需要克服AML1-ETO的促凋亡效应.的确,实验中发现,t(8;21)阳性的细胞Kasumi-1和SKNO-1与其它白血病细胞的凋亡敏感性并没有显著差异.这些研究结果已经在《LEUKEMIA》(影响因子为6.612)发表. 在上述研究过程中,意外发现,不论是诱导表达的还是组成型表达的AML1-ETO都在凋亡过程中伴随caspase-3的活化而降解产生70、49、40和25kDa四个片段.以此发现为基础,进一步发现caspase-3的特异性抑制剂可以显著抑制细胞凋亡过程中发生的.AML1-ETO降解.利用体外实验结合质谱技术证实AML1-ETO和野生型ETO是caspase-3的直接底物.通过定点致突变的方法识别出 TMPD<188>和LLLD<386>为AML1-ETO序列上caspase-3的作用位点. 最后,对caspase-3剪切AML1-ETO在细胞凋亡中的作用进行了研究.为此,分别构建了AML1-ETO的各剪切片段及caspase-3剪切位点突变的AML1-ETO的四环素.关闭诱导表达的U937细胞系,发现D188和D368剪切位点同时突变的AML1-ETO丧失了促凋亡的能力,而189-752这一剪切片段与野生型AML1-ETO类似,可以显著增强细胞的凋亡敏感性.表明AML1-ETO被caspase-3剪切是其凋亡增敏作用所必需的,并且189-752剪切片段介导了这一效应.因此,作为caspase-3的底物,AML1-ETO可以通过调控凋亡相关基因以及自身剪切等机制增强细胞的凋亡敏感性. 总之,本研究初步揭示了AML1-ETO融合蛋白与白血病细胞凋亡的潜在关系,对于探索AML1-ETO相关的白血病的发生机制提供了重要理论依据,并为细胞凋亡机制的认识及其与肿瘤发病学的关系提供了新的思路.