大蒜和大姜都是重要的食用调味剂,具有相当大的经济效益,在我国拥有悠久的栽培历史,但是一直缺乏科学系统的栽培管理。近些年农户为了追求短期的经济效益,在种植过程中大量施用化肥和农药,不仅影响了大蒜和大姜的品质以及植株的抗病性,而且造成面源污染和土壤板结等一系列环境问题,从而引发了食品安全和农业可持续发展等社会关注的热点问题。微生物菌剂是由一种或多种特定的、高浓度的、非致病性的有益微生物组成的可作为生物肥料或农药应用于农业生产的活体制品。微生物菌剂能通过直接或间接地途径刺激植株生长或增强植株抵抗病害的能力,是农用化学品的一种可靠的替代品。与氮素化肥相比,微生物菌剂对环境友好,性价比更高。荧光假单胞菌（Pseudomonas protegens）是目前应用最普遍,效果最好的一类根际促生菌和植物病害生防菌。P.protegens CHAO能成功在植物根际定殖,但是该菌株不具备生物固氮能力。之前,本实验室构建了一株荧光假单胞菌基因工程固氮菌CHA0-ΔretS-nif。该研究将CHA0基因组中负责抗生素合成的负调控基因retS敲除,增强了菌株的抗菌活性,并将来源于Pseudomonas stutzeri DSM 4166的长约49 kb的完整的固氮基因岛整合于CHA0-ΔretS基因组中,使菌株CHA0-ΔretS-nif兼具高效生防活性和生物固氮功能。本研究将CHA0-ΔretS-nif制备成规模化生产的液体菌剂,通过大田试验,探究了该菌剂对大蒜和大姜的促生效果,为CHA0-ΔretS-nif的推广利用以及大田合理科学的施肥管理提供理论依据。大田大蒜试验于2017年10月8日至2018年5月23日在山东省济宁市鱼台县鱼城镇进行。相比无任何菌剂接种的对照组,接种CHA0-ΔretS-nif菌剂对大蒜植株有明显的促生效果。CHA0-ΔretS-nif菌剂对大蒜植株的促生效果直接表现为蒜头和蒜薹产量的显著增加（P＜0.05）。与对照组相比,CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组蒜头和蒜薹的增产率分别为10.93%和17.99%。接种CHA0-ΔretS-nif菌剂对蒜头维生素C、硝酸盐和可溶性固形物的积累未表现出明显的促进作用,但有利于大蒜鳞茎大蒜素的合成。CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组新鲜蒜瓣大蒜素的含量比对照组提高17.86%。根腐病是大蒜常见病害,可直接影响蒜头、蒜薹的产量和农户经济收入。CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组植株的病情指数为2.65%,显著低于对照组（3.31%）（P＜0.05）。接种CHA0-ΔretS-nif菌剂不仅能促进大蒜植株的生长发育,抑制大蒜根腐病害的发生率,提高健康蒜头和蒜薹的产量,还有利于大蒜鳞茎大蒜素的合成和积累。当工业氮肥减施25%后,CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组植株的病情指数降为2.72%,蒜头产量、蒜薹产量和蒜瓣大蒜素含量分别比对照组提高了 10.55%、11.30%和14.29%,说明接种CHA0-ΔretS-nif菌剂能部分代替工业氮肥的施用,提高大蒜的种植效益和氮肥的生产效力,并且不会影响大蒜的营养品质。此外,减施工业氮肥配施CHA0-ΔretS-nif菌剂,大蒜根际土壤微生物总量和细菌的总量相比对照组显著增加（P＜0.05）,土壤微生物的群落结构和根际细菌的丰度得以改善。大姜试验于2018年4月2日至2018年10月15日在山东省昌邑市北孟镇李家庄子村进行。相比无任何菌剂接种的对照组,接种CHA0-ΔretS-nif菌剂对大姜植株有明显的促生效果。与对照组相比,CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组鲜姜的总产量显著提高12.93%（P＜0.05）。虽然接种CHA0-ΔretS-nif菌剂对大姜全株磷素的积累无明显促进作用,但可促进氮素和钾素的积累。在收获期,CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组大姜全株氮素和钾素的积累量分别比对照组提高29.05%和23.19%（P＜0.05）。接种CHA0-ΔretS-nif菌剂对鲜姜总酚、总黄酮、可溶性糖和淀粉的含量无明显促进作用,但是能显著提高鲜姜粗蛋白的含量（P＜0.05）。CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组鲜姜粗蛋白的含量比对照组提高了 34.65%。当工业氮肥减施15%后,CHA0-ΔretS-nif菌剂处理组鲜姜的产量、植株氮素和钾素的积累量,以及鲜姜粗蛋白的含量分别比对照组提高了 3.33%、18.17%、28.04%和31.26%。但是,当工业氮肥减施30%后,大姜的产量低于对照组,表明接种CHA0-ΔretS-nif菌剂只能在一定程度上弥补工业氮肥的缺失,当工业氮肥过量减施后,由于大姜植株在生长过程中不能获得充足的氮素,就会导致其生长发育受到抑制。此外,减施工业氮肥配施CHA0-ΔretS-nif菌剂大姜根系周围蚯蚓的数量、根际土壤微生物总量和细菌总量比对照组显著增加（P＜0.05）,有利于土壤动物和根际微生物的存活和繁殖。综上,接种CHA0-ΔretS-nif菌剂可为植株的构建提供更多氮素营养,作为一种新的、对环境友好的肥源应用于蔬菜生产,减轻农用化学品滥用造成的资源浪费和环境污染等问题。农杆菌介导的遗传转化是对经济作物进行遗传改良的重要手段之一,也是目前提高作物产量和品质的常用手段。除了根癌农杆菌介导的遗传转化,发根农杆菌（Rhizobium rhizogenes,之前命名为Agrobacterium rhizogenes）也可以用做外源DNA转入植物细胞的载体。目前,发根农杆菌介导的外源基因的转化理论基础如功能蛋白的作用机制和调控机理等仍不完善。由于缺乏高效率的同源重组系统,对发根农杆菌进行遗传操作较为困难。Red/ET重组系统可以精确高效地利用两端带有短同源臂的PCR产物或者人工合成的双链或单链寡核苷酸对大肠杆菌细胞内包含完整基因信息的基因组、质粒和人工染色体等DNA分子进行修饰操作。但是,大肠杆菌Red/ET重组系统在亲缘关系较远的细菌中并不能有效介导同源重组过程。近年来,研究人员在其它细菌中也陆续寻找到了类似的重组蛋白,建立起相似的具有高效率的同源重组系统,扩展了该技术的应用范围,推动了整个基因工程技术的发展。本部分研究旨在R.rhizogenes中开发出一套高效简捷的类似大肠杆菌Red/ET的基因组修饰系统。在R.rhizogenes中建立起高效的基因组编辑技术,在菌株遗传改造和基因功能研究以及转基因经济作物的构建等方面都具有重要的应用价值。试验材料为模式菌株R.rhizogenes NBRC 13257。源于大肠杆菌λ噬菌体的Red重组系统在NBRC 13257胞内不能有效地指导同源重组的发生,而且NBRC 13257基因组不编码类似Redα/β或RecE/T重组酶。应用NCBI BLASTP程序,使用单链DNA退火蛋白Redβ、RecT和Pluβ的氨基酸序列,在所有完成基因组测序的农杆菌和根瘤菌基因组或其噬菌体、原噬菌体基因组中,搜索与Redβ、RecT和Pluβ同源的蛋白。由于介导双链DNA分子之间发生同源重组的5’-3’核酸外切酶和单链DNA退火蛋白的编码基因通常成对存在于一个操纵子中,本研究共筛选出四组同时含有5’-3’核酸外切酶和单链DNA退火蛋白编码基因的操纵子。四组操纵子除编码重组酶蛋白对外,还编码了若干未知功能的蛋白,统称为假定蛋白。操纵子经人工合成后克隆至广宿主表达载体。重组酶蛋白的表达受四环素诱导型启动子的严格调控。为了更好的将外源DNA分子转入NBRC 13257胞内,本部分试验首先对该菌株的电转化条件进行了优化。处于对数生长期初期（OD600约为0.4～0.6）的细胞更适合进行电转操作。当电转缓冲液使用SH buffer（10%蔗糖+2 μM HEPES）,电场强度为1900 V/mm,DNA的用量为1500 ng,在常温制备感受态细胞时,转化效率最高,每μg DNA可获得约2.6 × 105个转化子。将构建好的重组酶表达载体分别转入菌株NBRC 13257中比较重组效率。只有来源于Rhizobium sp.Root483D2的重组酶系统RecEThRHI483在NBRC 13257细胞中能有效介导两端携带有80 bp同源臂的外源双链DNA分子与特定基因发生同源重组。加入核酸外切酶抑制蛋白Redγ或Pluy可轻微提高RecEThRHI483系统的重组效率。将RecEThRHI483系统中存在的一个假定蛋白删除后,重组效率大约降低一半。最后,本试验成功使用PluγEThRH1483系统和两端携带80 bp同源臂的双链DNA底物对NBRC 13257基因组进行了修饰,获得了两株基因缺失突变株,证明新建立的同源重组系统可用于NBRC 13257基因组修饰。PluγEThRHI483系统工作的最佳诱导温度和诱导时间分别为 28℃和 0.5 h。