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研究目的二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)是无色、略带氨味的透明液体,因其可以与水及多数有机溶剂互溶而被誉为“万能溶剂”,广泛应用于医药、农药、聚丙烯腈抽丝、聚胺酯合成革等多个领域。尽管DMF具有其它有机溶剂无可比拟的优势,但其暴露可导致重度肝损伤,且临床上缺乏有效的治疗药物。近年来我国由DMF引起的肝中毒病例不断涌现;DMF职业性肝中毒已成为我国不容忽视的公共卫生问题。氧化应激和枯否细胞(Kupffercells,KCs)介导的炎症参与了多种肝脏疾病的发生和发展。已有的研究表明,DMF在肝细胞内经细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)代谢生成的活性代谢中间产物异氰酸甲酯(methyl isocyanate,MIC)可以与还原型谷胱甘肽(gluathione,GSH)形成加合物导致肝细胞内GSH耗竭;同时,DMF经CYP2E1代谢过程中会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS);二者均可以导致氧化应激。然而氧化应激是DMF引起肝损伤的主要病因?还是DMF肝毒性发生过程中的伴随现象?仍待揭示。KCs占机体内各组织中定居巨噬细胞总数的80%～90%,占肝脏非实质细胞的近三分之一,因此在维持肝脏组织及机体稳态中都具有关键作用。KCs被激活后会释放多种炎症介质加重肝脏损伤。KCs是否参与了 DMF诱导的肝损伤的发病?目前尚未见研究报道。本研究通过整体动物实验,研究DMF急性染毒的ICR雄性小鼠肝脏氧化应激相关指标的变化,采用广谱抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)和调控细胞内抗氧化系统的核转录因子E2相关因子(nuclear factor erythriod 2-relatedfactor2,Nrf-2)的激动剂萝卜硫素(sulforaphane,SF)进行干预,探讨氧化应激在DMF急性肝损伤发病中作用;并进一步观察KCs清除剂氯化钆(gadoliniumchloride,GdCl3)对DMF致小鼠急性肝损伤的保护作用;以期初步揭示DMF急性肝损伤作用的发病机制,为其有效预防药物的筛选提供理论依据。研究方法1 Bliss法测定DMF对雄性ICR小鼠的半数致死剂量(LD50)SPF级雄性ICR小鼠50只,体重(18～22 g),适应性喂养3天后,随机分成 5 组(n=10);分别以 4.50、5.49、6.71、8.19 和 10.00g/kgbw 经口灌胃染毒,连续观察7 d;采用Bliss法计算DMF对ICR雄性小鼠的经口半数致死剂量(LD50)。2 DMF急性肝损伤小鼠模型的建立SPF级雄性ICR小鼠40只,体重(18～22 g),适应性喂养3天后,随机分成 4 组(n=10):对照组、DMF(24h)组、DMF(48h)组、DMF(72h)组。各 DMF组小鼠禁食8 h后经口灌胃染毒(3 g/kg bw)。分别在相应时间点处死各组小鼠,摘眼球取血,收集血清测定丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的活性;分离肝脏组织,通过HE染色法评价肝脏损伤的程度。3 DMF急性肝损伤小鼠肝脏氧化应激指标的测定采用试剂盒测定肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)和GSH的含量;提取肝脏总蛋白,western blotting法测定肝脏组织中4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的表达含量。4 Nrf-2通路相关蛋白表达及mRNA水平的测定提取肝脏总蛋白,western blotting法测定肝脏组织中Nrf-2及其下游相关基因的蛋白表达水平;qRT-PCR法检测Nrf-2及其下游相关基因的mRNA表达水平。5 NAC对小鼠DMF急性肝损伤的干预作用SPF级雄性ICR小鼠60只,体重(18～22g),随机分为6个组(n=10):对照组、DMF 组、不同剂量 NAC 干预组(62.5mg/kgbw、125mg/kgbw、250mg/kg bw、500mg/kgbw)。各干预组小鼠分别经腹腔注射给予不同剂量的NAC,连续5 d;5 d后,DMF组和NAC干预组小鼠经口灌胃染毒(3 g/kg bw),对照组小鼠给予等体积的蒸馏水。各组小鼠均于DMF染毒后48小时处死,收集血清测定ALT和AST的活性;分离肝脏,进行HE染色;采用试剂盒测定肝脏组织中MDA和GSH的含量。6 SF对小鼠DMF急性肝损伤的干预作用SPF级雄性ICR小鼠40只,体重(18～22g),随机分为4个组(n=10):对照组、DMF组、SF组、DMF+SF组。SF组和DMF+SF组小鼠腹腔注射SF(30 mg/kg bw,1次/d),连续5d;5d后,DMF组和DMF+SF组小鼠灌胃给予3/kg bw DMF,其余两组小鼠分别给予等体积无菌生理盐水。各组小鼠均于DMF染毒后48小时处死,测定血清ALT和AST活性;分离肝脏组织,采用HE染色法进行肝脏病理学评价;采用试剂盒测定肝脏组织中MDA和GSH的含量;western blotting法测定Nrf-2等相关蛋白的表达水平。7 GdCb对小鼠DMF急性肝损伤的干预作用SPF级雄性ICR小鼠40只,体重(18～22g),随机分为4个组(n=10):对照组、DMF组、GdCl3组、DMF+GdCl3组。GdCl3组和DMF+GdCl3组小鼠腹腔注射GdCl3(10 mg/kg bw),24 h后灌胃给予3 g/kg bw的DMF;对照组给予同等体积的蒸馏水。各组小鼠均于DMF染毒后48小时处死,收集血清测定ALT和AST的活性;分离肝脏,通过HE染色法进行肝脏组织病理学检查。研究结果1 DMF对雄性ICR小鼠的半数致死剂量(LD50)DMF染毒小鼠活动减少、体重下降;4.5g/kgbw剂量组死亡1只;5.49g/kg bw剂量组死亡2只;6.71 g/kg bw剂量组死亡8只;8.19 g/kg bw剂量组死亡9只;10.00 g/kg bw剂量组死亡10只。经Bliss法计算得到DMF经口 LD50为6.0583 g/kg bw(95%可信限:5.4319-6.7061 g/kg bw)。2 DMF急性染毒ICR小鼠肝脏损伤指标的动态变化与对照组小鼠相比,DMF染毒组小鼠体重在24 h、48 h和72 h个时间点均显著降低(P<0.01);染毒组小鼠肝脏重量和脏器系数、血清转氨酶活性在48 h和72h时间点显著增加(P<0.01)。肝脏组织病理检查显示,DMF染毒组肝细胞肿大、部分肝细胞坏死、大量的炎性细胞浸润,其中48h组小鼠肝脏损伤现象最严重。3 DMF急性染毒小鼠肝脏氧化应激指标的变化与对照组小鼠相比,DMF染毒组小鼠肝组织MDA的含量在24 h和48 h两个时间点显著增加(P<0.05);DMF染毒组小鼠肝脏组织中GSH的含量与GSH/GSSG比值在48 h时间点显著下降(P<0.05);DMF染毒组小鼠肝脏蛋白中4-HNE蛋白加合物含量在48 h和72 h两个时间点显著增加(P<0.05)。4 DMF肝损伤小鼠肝脏Nrf-2通路相关分子蛋白和mRNA水平的变化与对照组小鼠相比,DMF染毒小鼠肝脏Nrf-2蛋白表达在3个检测时间点均显著升高(P<0.01);Keap-1的蛋白表达水平在检测的3个时间点均呈现降低的趋势(P<0.01);NQO-1的表达水平在48h和72h组明显升高(P<0.01);HO-1的蛋白表达水平呈现明显降低的趋势(P<0.01);SOD的表达水平在24h和48 h组呈现降低趋势(P<0.05);γ-GCS蛋白表达水平在DMF各染毒组均无明显变化(P>0.05)。与对照组小鼠相比,DMF染毒组小鼠Nrf-2的mRNA水平无明显差异(P>0.05);NQO-1、SOD、GCLc 和 GCLm 的 mRNA 水平在 24h 时间点均呈现升高的趋势(P<0.01);NQO-1的mRNA水平在48h组明显升高(P<0.01);SOD和GCLm的mRNA水平在48 h时间点显著下降(P<0.01);NQO-1、SOD、GCLc、GCLm的mRNA水平在72 h时间点均无明显差异(P>0.05)。5抗氧化剂NAC对DMF致小鼠急性肝损伤的干预效果评价5.1 NAC干预对小鼠体重、肝脏重量及脏器系数的影响与对照组小鼠相比,DMF模型组小鼠体重显著降低(P<0.01),肝脏重量及肝脏系数显著增加(P<0.01)。与模型组小鼠相比,各NAC干预组小鼠体重、肝脏重量及脏器系数均无显著差异(P>0.05)。5.2 NAC干预对小鼠血清转氨酶活性的影响与对照组小鼠相比,DMF模型组小鼠血清ALT和AST活性显著升高(P<0.01)。与模型组小鼠相比,各干预组小鼠血清ALT和AST活性无显著差异(P>0.05)。5.3 NAC干预对DMF导致的急性肝损伤小鼠肝脏的病理学检查与对照组小鼠相比,DMF模型组小鼠肝脏可见明显损伤,表现为肝细胞肿大、细胞坏死、炎性细胞浸润、细胞核缩小等。与DMF模型组小鼠相比,NAC各剂量干预组小鼠肝损伤状况无明显改变。5.4 NAC干预对小鼠氧化应激相关指标的影响与对照组小鼠相比,DMF模型组小鼠肝脏组织中MDA含量增加(P<0.05),GSH的含量显著降低(P<0.05)。与DMF模型组小鼠相比,NAC各剂量干预组小鼠肝组织MDA含量均呈现降低趋势(P<0.01),GSH含量显著升高(P<0.01)。6 Nrf-2激活剂SF对DMF致小鼠急性肝损的干预效果评价6.1 SF干预对小鼠体重、肝脏重量及肝脏系数的影响与对照组小鼠相比,模型组小鼠体重显著降低(P<0.01),肝脏重量及肝脏系数显著增加(.P<0.01)。与模型组小鼠相比,SF干预组小鼠体重、肝脏重量及肝脏系数无显著差异(P>0.05)。6.2 SF干预对小鼠血清转氨酶活性的影响与对照组小鼠相比,模型组小鼠血清ALT和AST活性显著增加(P<0.01)。与模型组小鼠相比,SF干预组小鼠血清ALT和AST活性无显著差异(P>0.05)。6.3 SF干预对DMF导致的急性肝损伤小鼠肝脏的病理学检查病理学检查显示,与模型组小鼠相比,SF干预组小鼠肝脏损伤无显著改善。6.4 SF干预对小鼠氧化应激相关指标的影响与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏组织中MDA含量显著增加(P<0.01),GSH含量显著下降(P<0.05)。与模型组小鼠相比,SF干预组小鼠肝脏组织中MDA含量显著下降(P<0.05),GSH水平显著增加(P<0.05)。6.5 SF干预对Nrf-2及其相关蛋白表达水平的影响与对照组小鼠相比,DMF模型组小鼠肝组织Nrf-2和NQO-1蛋白水平显著增加(P<0.01),SF单独应用组小鼠Nrf2和NOQ-1蛋白含量显著增加(P<0.01)。与DMF模型组小鼠相比,SF干预组小鼠肝组织Nrf-2的表达进一步升高(P<0.01),NQO-1和HO-1的蛋白表达水平呈现上升的趋势(P>0.05)。7 DMF急性染毒小鼠肝脏炎性相关蛋白表达水平的变化与对照组小鼠相比,DMF染毒小鼠肝脏组织中p65表达水平在24 h和48 h时间点显著增加(P<0.01);p-p65的蛋白表达水平在24 h、48 h和72 h三个时间点都显著增加(P<0.01);iNOS的表达水平亦在DMF暴露后3个检测时间点均显著增加(P<0.01)。8枯否细胞清除剂GdCl3对DMF致小鼠急性肝损伤的干预效果评价8.1 GdCl3干预对小鼠体重、肝重及肝脏系数的影响与对照组小鼠相比,DMF染毒模型组小鼠体重显著降低(P<0.01),肝脏重量与肝脏系数显著增大(P<0.05)。与模型组小鼠相比,GdCl3干预组小鼠体重、肝重和肝脏系数无明显差异(P>0.05)。8.2 GdCl3干预对小鼠血清转氨酶活性的影响与对照组小鼠相比,DMF模型组小鼠血清AST和ALT活性显著升高(P<0.01)。与DMF模型组小鼠相比,GdCl3干预组小鼠血清ALT和AST活性均显著降低(P<0.05)。8.3 GdCl3干预对DMF导致的急性肝损伤小鼠肝脏的病理学检查与对照组小鼠相比,DMF组小鼠肝脏组织呈现肝细胞肿大,肝细胞坏死,炎性细胞浸润,细胞核缩小等肝组织损伤现象。与DMF模型组小鼠相比,GdCl3干预组小鼠肝损伤状况明显改善。研究结论1.DMF对雄性ICR小鼠的经口LD50为6.0583 g/kg(95%CI:5.4319-6.7061 g/kg)。2.DMF急性染毒小鼠肝脏氧化应激水平增加,但抗氧化剂SF和NAC不能通过减轻氧化应激来保护肝脏,提示ROS可能不是DMF诱导小鼠急性肝损伤的主要病因。3.KCs清除剂GdCl3可以显著抑制DMF急性肝损伤,提示枯否细胞介导的肝脏炎症可能在DMF急性肝损伤的发病中起着重要作用。