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背景Th17细胞在非嗜酸性粒细胞性哮喘(NEA)的发生发展中具有重要作用,其通过分泌一系列细胞因子介导了具有激素抵抗特征的中性粒细胞性气道炎症。血红素加氧酶(HO)-1是血红素代谢途径的限速酶,在各种Th细胞介导的自身免疫性疾病中发挥广泛的抗炎及免疫调节功能,但其在NEA中的作用尚不清楚。课题组前期研究已发现诱导HO-1表达能抑制EA小鼠模型中Th2介导的嗜酸性粒细胞性气道炎症,表明HO-1对哮喘气道炎症具有拮抗作用。本研究将在此基础上进一步研究HO-1在NEA模型中对Th17/Treg细胞平衡的作用及机制。目的通过体内外实验研究Th17/Treg细胞及其分泌的相关细胞因子在NEA哮喘模型中的作用,并在此基础上干预HO-1表达以阐明HO-1能否调控Th17/Treg细胞平衡及其机制,为临床认识与防治重度/难治性哮喘提供新的干预靶点和实验依据。方法1、利用DO11.10转基因小鼠建立NEA模型,经鼻吸入OVA诱导哮喘气道炎症,并在此基础上经腹腔注射hemin或Sn PP干预HO-1表达。通过Western blot检测肺组织HO-1表达,BALF细胞分类计数和观察肺组织病理改变,以评估HO-1对NEA模型中性粒细胞性气道炎症的作用。2、FCM检测小鼠纵隔淋巴结(MLN)和脾脏中Th17/Treg细胞比例,Western blot检测肺组织RORγt/Foxp3表达水平,ELISA检测BALF中IL-17A/IL-10含量,以观察HO-1调控Th17/Treg细胞平衡的作用;同时FCM检测MLN和脾脏中Th1/Th2比例,Real-time PCR检测肺组织T-bet/GATA-3 m RNA表达,ELISA检测BALF中IFN-γ/IL-4含量,以观察NEA模型中Th1/Th2细胞变化及HO-1对其的影响。3、在已建立的NEA模型基础上,经尾静脉注射体内转染HO-1 si RNA和腹腔注射hemin干预HO-1表达,通过观察肺组织病理改变,Western blot检测肺组织HO-1和RORγt表达水平,以证实HO-1 si RNA可逆转hemin拮抗气道炎症和抑制Th17细胞反应的作用。4、分离小鼠脾脏na?ve T细胞并在Th17或Treg细胞培养条件下体外诱导分化,在此基础上加入一定浓度的hemin或Sn PP干预HO-1表达,通过FCM检测Th17/Treg细胞比例,Real-time PCR检测RORγt和IL-17A/IL-10 m RNA表达,ELISA检测上清液中IL-17A含量,以观察HO-1体外对na?ve T细胞向Th17/Treg细胞分化的影响。5、小鼠腹腔注射hemin或Sn PP干预细胞中HO-1表达,分离CD4+T细胞并加入IL-6/IL-2刺激1小时体外诱导STAT3/STAT5磷酸化,Western blot检测p-STAT3/p-STAT5及STAT3/STAT5表达水平,以进一步阐明HO-1调节Th17/Treg细胞分化的机制。结果1、OVA激发DO11.10小鼠能产生Th17细胞介导的以PMN浸润为主的抗原特异性气道炎症,给予HO-1诱导剂hemin上调HO-1表达后,可显著抑制气道炎症并降低BALF中细胞总数和PMN数量。2、Hemin诱导HO-1高表达明显降低NEA小鼠模型中脾脏和MLN Th17细胞亚群比例,下调肺组织RORγt表达并减少BALF中IL-17A含量,同时显著增加Treg细胞比例和IL-10水平,从而抑制Th17免疫反应,。3、体内HO-1 si RNA干预可逆转hemin的抗炎效应,同时HO-1对Th17细胞的抑制作用也减弱。4、Hemin诱导HO-1高表达可通过抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化下调RORγt表达,抑制na?ve T细胞向Th17细胞分化并促进其向Treg细胞分化,调节Th17/Treg细胞平衡。结论1、HO-1可抑制OVA诱导的NEA气道炎症模型中Th17免疫反应,同时上调Treg细胞,重建体内Th17/Treg细胞平衡,以此抑制OVA诱导的NEA气道炎症。2、HO-1通过抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化通路而下调RORγt表达,抑制体外Th17细胞培养条件下na?ve T细胞向Th17细胞分化并促使其向Treg细胞分化,从而实现负向调控体内Th17细胞介导的免疫反应。3、HO-1可为重症/难治性哮喘和其他Th17细胞介导的自身免疫性疾病的防治提供新治疗靶点。