目的:杜兴肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy-DMD)是一种致死性的X染色体连锁遗传的神经肌肉失调症,目前临床未有任何有效的治疗方法。反义寡核苷酸介导的外显子跳读疗法成为杜兴肌肉萎缩症基因治疗中最有应用前景的方法之一,但最近III期临床试验结果未能达到预期目标,究其根本原因是由于药物系统运输效率低所致。因此,亟需研发新型、高效的运输辅助剂,以提高反义寡核苷酸药物在肌肉中的系统运输效率。针对这一关键科学问题,前期工作中,我们在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型测试了一系列新型运输辅助剂,发现F5表现出对反义寡核苷酸药物活性提高作用。本论文基于前期工作基础,在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型上系统测试了包括F5在内的几种候选新型运输辅助剂对不同反义寡核苷酸药物活性增强作用,进而对效果最佳的F5展开全面、系统测试及安全性评估,预期为反义寡核苷酸药物的系统运输提供一种新途径和新策略,同时为新型运输辅助剂的临床应用提供重要实验依据和理论指导。另外,本论文还对其他潜在的杜兴肌肉萎缩症小鼠模型展开探索,以期为DMD反义寡核苷酸药物筛选及杜兴肌肉萎缩症治疗研究提供一种更容易获取和实用的小鼠模型,可进一步加速反义寡核苷酸药物及DMD新治疗方法研发进程。方法:1.基于前期筛选工作,将5种效果较优的候选辅助剂(F4、F5、F9、F10及F12)分别与5μg MOE在mdx小鼠的前胫骨肌上进行局部肌肉注射,两周后收取肌肉组织,利用IHC和RT-PCR分别检测dystrophin阳性肌纤维表达和分布及外显子跳读效率,通过定量分析以评估其作用效果。2.将上述5种辅助剂与5μg肽核酸(Peptide Nucleic Acid-PNA)在mdx小鼠上进行局部肌肉注射,两周后收取肌肉组织,利用IHC、RT-PCR及Western Blot在RNA及蛋白水平检测外显子跳读和dystrophin蛋白恢复表达情况,以评估辅助剂对PNA活性的增强作用;通过比较分析,以确认同种辅助剂对不同药物的作用效果,从而筛选出效果最佳的辅助剂。3.将优选辅助剂F5分别与不同反义寡核苷酸药物,包括2μg PMO,2μg M12-PMO,1μg B-MSP-PMO和2μg R-PMO,在mdx小鼠上进行局部肌肉注射,两周后收样,利用IHC、RT-PCR和Western Blot检测外显子跳读及dystrophin蛋白恢复表达情况,以探究F5对不同反义寡核苷酸药物的作用效果,从而确定F5与反义寡核苷酸药物的最佳组合。4.F5浓度效应研究,通过降低或提高F5浓度(F5A为2.5%;F5B为7.5%)与组合效果最优的PMO进行局部肌肉注射,两周后收样,利用上述检测方法在RNA和蛋白水平上,分别测试外显子跳读效率和dystrophin蛋白恢复表达情况,与F5(5%)比较,从而确定F5最佳使用浓度。5.为评估F5对PMO系统增强作用,将25 mg/kg的PMO通过尾静脉注射到成年mdx小鼠中,每周注射一次,连续注射3周,两周后收取全身肌肉组织及肝、肾脏等。利用与上述相同的检测方法,在RNA及蛋白水平上测试F5对PMO活性的增强作用,以评价F5对PMO的系统效果。同时利用组织免疫染色检测F5对肌肉和肝及肾脏是否造成潜在毒副作用。6.在前期研究中,我们发现新型运输辅助剂F9是通过提高反义寡核苷酸药物在组织中的摄取,而增强反义寡核苷酸药物的活性。为测试F5是否同样提高反义寡核苷酸药物在组织中的摄取而起作用,我们采用lissamine荧光标记PMO与F5在mdx小鼠上共注射。25 mg/kg lissamine标记的PMO与F5通过尾静脉注射到成年mdx小鼠中,每天注射一次,连续注射3天,四天后收取全身组织样品包括肌肉及肝、肾等非肌肉组织,通过小动物成像,检测各组织中lissamine荧光标记的PMO的荧光强度,以确定F5对PMO在mdx小鼠组织分布变化情况。同时利用上述提到的RT-PCR和Wetsern Blot方法,检测F5对PMO的作用效果。7.基于上述试验结果,在mdx小鼠模型上,系统测试F5对PMO的长期作用效果。将50 mg/kg的PMO与F5通过尾静脉注射方式,每周注射1次,连续注射3次;随后,每月注射1次,连续注射5次,最后一次注射后两周,收取全身组织包括肌肉及肝、肾等。利用IHC、RT-PCR和Western Blot在RNA及蛋白水平上检测PMO介导外显子跳读和dystrophin蛋白恢复表达情况;同时通过抓力测试、dystrophin蛋白复合物、血清中肌酸激酶、天冬氨酸转移酶等指标检测及组化染色等方法,系统评估F5对PMO的增强效果和对mdx小鼠功能改善情况及潜在的毒副作用,以确定F5对反义寡核苷酸药物PMO的长期作用效果。8.为测试野生型小鼠作为杜兴肌肉萎缩症模型的可行性,我们将6种不同的反义寡核苷酸药物在正常野生C57BL/6小鼠的胫前肌上进行局部注射,在48 h后收取肌肉组织,利用RT-PCR方法在RNA水平上检测外显子跳读效率,并与杜兴肌肉萎缩症模型小鼠模型(mdx)进行比较,以确定野生型小鼠C57BL/6作为DMD反义寡核核苷酸药物活性检测模型的可行性。9.在野生型小鼠C57BL/6模型上,测试反义寡核苷酸药物PMO、PNA、2’OMe作用的时间效应,以48 h,2-week和4-week作为测试时间点,利用RT-PCR方法检测外显子跳读效率;通过与mdx小鼠作用效果比较,以确定在野生型小鼠C57BL/6上检测外显子跳读的最佳时间点。10.利用苏木精-伊红染色处理组肌肉组织,以确认不同反义寡核苷酸药物在不同时间点是否对局部肌肉组织造成损伤。11.将上述三种不同反义寡核苷酸药物,分别在ICR、C3H及BABL/C小鼠前胫骨肌进行局部测试,48 h收样,利用RT-PCR测试不同反义寡核苷酸药物在不同小鼠模型上的外显子跳读效率,以确定其他野生型小鼠作为DMD反义寡核苷酸药物活性测试模型的可行性。12.在野生型小鼠C57BL/6和C3H上系统测试PMO介导外显子跳读效率,并与mdx小鼠进行比较。通过低剂量,多次重复尾静脉注射(25mg/kg,每周注射1次,连续注射3次),两周后收取全身肌肉组织,利用RT-PCR检测不同组织中PMO介导的外显子跳读效率。与mdx小鼠比较,以确定野生型小鼠作为DMD反义寡核苷酸药物系统活性测试模型的可行性。结果:1.通过5种不同辅助剂(F4、F5、F9、F10及F12)与MOE在mdx小鼠前胫骨肌中的局部测试,结果发现:与生理盐水相比,5种辅助剂均能提高反义寡核苷酸药物MOE的外显子跳读活性和dystrophin蛋白表达水平,其中以F5和F12效果最明显,效率提高分别达到生理盐水的3.53及3.45倍。2.通过对5种辅助剂(F4、F5、F9、F10及F12)与反义寡核苷酸药物PNA在mdx小鼠上的局部测试结果表明:与生理盐水相比,5种辅助剂均能提高PNA外显子跳读效率及dystrophin蛋白表达水平,增强效率在1.27~1.54倍之间;而5种辅助剂之间无明显差异。通过比较同种辅助剂对不同反义寡核苷酸药物的增强作用,从而确定F5增强效果最为明显。3.在F5与不同反义寡核苷酸药物局部测试中,结果表明:F5不但能显著提高PMO、PNA和MOE介导外显子跳读能力,而且能提高其他不同类反义寡核苷酸药物包括M12-PMO、B-MSP-PMO和R-PMO的局部外显子跳读效率。其中,F5对PMO增强作用最为明显,达到4.24倍。4.对F5浓度效应测试结果表明:浓度为5%的F5对PMO作用效果优于其他两个测试浓度包括2.5%和7.5%,进一步确认浓度为5%的F5为最佳测试浓度。5.通过F5与PMO在mdx小鼠上的系统测试,确认F5能显著提高PMO介导外显子跳读和dystrophin蛋白恢复表达能力。组织化学染色结果未发现任何药物相关的毒副作用。6.在mdx小鼠模型上,进一步测试了F5对荧光标记PMO组织分布和摄取作用。结果表明:F5能促进PMO在各组织中的摄取,尤以肌肉中效果最为明显,但不改变药物的组织分布;说明F5通过提高PMO在肌肉组织中的摄取,从而提高PMO介导外显子跳读和dystrophin蛋白恢复表达能力。7.利用mdx小鼠模型对F5与PMO的长期测试结果表明:长期重复注射PMO与F5能够介导外显子跳读和恢复dystrophin蛋白表达,改善mdx小鼠的生理功能和病理状态。但与生理盐水相比,F5未表现出显著提高作用。相关的免疫细胞检测及组织病理染色显示,重复使用F5未引发机体免疫反应和药物相关毒副作用尽管长期重复注射F5和PMO减缓mdx小鼠疾病进程,但与生理盐水相比,没有显著性差异。8.对6种不同反义寡核苷酸药物在野生型小鼠C57BL/6上的测试结果表明:与mdx小鼠相比,6种不同反义寡核苷酸药物均能在C57BL/6小鼠上介导水平相近的外显子跳读,说明野生型小鼠C57BL6可作为DMD反义寡核苷酸药物活性局部测试模型。9.在C57BL/6小鼠上对PMO、PNA和2’OMe时间效应研究结果表明:不同反义寡核苷酸药物在不同时间点介导外显子跳读效率不同。PMO和PNA在注射4周后,外显子跳读效率最高;而2’OMe在注射两周后,外显子跳读效率高于其他时间点。整体上,三种反义寡核苷酸药物在注射后48 h都能检测到明显的跳读。进一步肌肉组织染色结果显示:三种反义寡核苷酸药物在不同时间点均未导致肌肉组织损伤。10.三种反义寡核苷酸药物PMO、PNA和2’OMe在其他野生型小鼠C3H、BABL/C和ICR上局部测试结果表明:与mdx小鼠相比,三种反义寡核苷酸药物均能在三种不同小鼠模型上介导外显子跳读,且在不同小鼠模型介导外显子跳读效率相当,其中以C57BL/6和C3H最接近mdx小鼠上的相应反义寡核苷酸介导外显子跳读水平。11.在野生型小鼠C57BL/6和C3H以及mdx小鼠上对PMO的系统测试结果表明,PMO在不同小鼠模型上介导全身肌肉组织中外显子跳读效率不同,其中以C57BL/6小鼠的系统外显子跳读效率最接近mdx小鼠。结论:1.通过在mdx小鼠上对5种候选辅助剂(F4、F5、F9、F10和F12)与不同反义寡核苷酸药物组合筛选,结果表明:5种辅助剂均能显著提高不同反义寡核苷酸药物的活性,但增强幅度有差异,以F5对PMO作用效果最为明显。2.F5浓度效应试验证明:5%的F5为最适使用浓度,对反义寡核苷酸药物增强效果最佳。3.对F5的系统测试结果显示:短期重复使用F5可高效地促进反义寡核苷酸药物的活性,但长期重复使用作用效果不明显。系统测试结果表明F5可作为反义寡核苷酸药物的运输辅助剂,提高反义寡核苷酸药物在肌肉组织中的生物活性,为其后续转化应用提供重要的实验依据和理论指导。4.对F5作用机理的初步测试,阐释F5是通过提高反义寡核苷酸药物在肌肉组织中的分布和摄取,从而提高其活性。5.对正常野生型小鼠模型的局部和系统测试显示:野生型小鼠可作为DMD反义寡核苷酸药物测试模型,但对反义寡核苷酸药物系统灵敏度略低于mdx小鼠。