植物原生质体细胞由于没有细胞壁,因此它可以作为一个研究细胞壁再生,细胞分裂、分化等基础理论研究的实验系统。同时它也可作为体细胞杂交、无性系变异及突变体筛选、分离细胞器的理想材料和遗传转化的受体。小孢子是单细胞,容易获得,不受花药组织的影响,具有单倍性,发育同步性,易加倍等优点,常常用来研究植物胚胎发育过程。小孢子胚胎发生提供了一种研究植物胚胎发育和植物细胞全能性而不受母体组织干扰的替代系统。本文通过对12种基因型烟草原生质体的培养,探索了不同基因型之间酶解时间、原生质体起始分裂的时间、诱导出芽生根时间和出芽率的差异;研究了不同培养基对烟草原生质体培养愈伤组织的诱导、分化生芽及不定芽生根的影响。通过对游离小孢子的培养,对小孢子胚胎发生的过程和发育模式进行基础的研究,证明了NtDRP可以作为烟草小孢子胚胎发生的一个标记基因。主要的实验结果如下:1.比较不同基因型烟草原生质体分离的酶解时间,随着酶解时间的延长,不同基因型烟草的叶肉细胞的原生质体开始分离出来,由于不同的基因型烟草对酶的敏感性不同,因此不同基因型所需的酶解时间也不同。烟草G3、G4、G5、SR1的最佳酶解时间为3h;G1、NtDRP的最佳酶解时间为3.5h;G2和G6的最佳酶解时间为4.5h;而G7、G8、G9和G10的酶解时间为4h时,其有活力原生质体的产量最高。结果表明相同的酶解条件下,生理状态相近的不同的基因型所需的酶解时间不同。烟草原生质体所需的酶解时间与基因型有关。2.将生理状态相近的幼嫩叶片,经相同的酶解分离纯化过程获得的原生质体,在相同的培养条件下进行培养,发现G1、G8、G10、SR1的原生质体细胞培养2d发生第一分裂,G4和G6的原生质体细胞直到培养5d才发生第一次分裂,其它基因型的原生质体细胞发生首次分裂的时间为培养的2-5d之间。除烟草G4原生质体细胞分裂次数较少,所得到的愈伤组织较少,其它基因型烟草培养的原生质体细胞都能多次分裂。将不同基因型相同大小的愈伤组织转入相同的分化培养基诱导生芽,烟草SR1、G1、G10愈伤组织最早分化出芽点,分化出芽所需的时间为16d,而G4、G6出芽所需的时间最长,为22d。统计不同基因型的出芽率,SR1的出芽率最高,达到97%;G7的出芽率最低,为60%,其他基因型的出芽率都在80%以上。研究发现在相同的培养条件,相同的生长环境、生理状态,不同基因型烟草原生质体细胞的分裂速率,分裂频率,所诱导出的愈伤分化出芽的能力却不同。烟草原生质体的分裂及分化与基因型有关。3.以13种含有不同激素成分和不同激素浓度的培养基,对原生质体进行愈伤组织的诱导和扩增,研究表明培养基及激素直接影响着原生质体愈伤组织的生长和分化。4培养基有利于促进愈伤组织的诱导、扩增,同时4号培养基也能诱导生芽。10和11号培养基既可以诱导形成较多的愈伤组织,也能分化产生大量的芽。因此,前期可以用4号培养基进行愈伤组织的诱导、增值,得到大量的愈伤组织,再将愈伤组织转移到10和11号培养基中分化生芽。4.以长势良好的烟草SR1为例,将烟草SR1原生质体培养诱导产生的不定芽切下转移到四种不同的培养基中进行诱导生根,发现1号培养基诱导生根比率较低,根量少,根虽然粗壮,但产生的根短,诱导生根所需要的时间长,约10d左右;2号培养基诱导生根率最低,根量少;而4号培养基生成的根虽短,诱导生根率却高达86%,生根时间却需要12d左右;以3号培养基最佳,其诱导生根的比率最高,高达92%,根量较多,根较粗壮且长,诱导生根仅需7d就可得到完整的植株。5.烟草小孢子在B培养基中经过饥饿和热激处理5d或6d,改变小孢子的发育途径,由配子体途径转向孢子体途径。在转入AT3培养基中培养2d,细胞核发生均等分裂,产生两个大小相似的细胞核,在培养过程中部分小孢子细胞外壁破裂,产生类似合子胚的发育模式,形成胚柄和胚体结构。具有完整外壁的小孢子经过45-60d,最终发育成子叶形胚胎。6.饥饿和热激对小孢子胚胎发生的诱导作用。饥饿和热激条件下的小孢子诱导胚胎发生的比率比正常温度(饥饿或非饥饿处理)或单独热激处理培养的小孢子不仅诱导效率高,还减少了对胁迫处理的依赖性。实验证明当两种胁迫处理相结合对提高小孢子胚胎发生的诱导率具有叠加效应。7.探索NtDRP基因是否可以作为小孢子胚胎发生的标记基因。在小孢子培养过程中,单核晚期的烟草小孢子在饥饿培养基中热激(32℃)处理后培养48h,小孢子不表达NtDRP,培养72h,小孢子开始表达NtDRP。通过pNtDRP::NtDRP-GFP,野生型SR1,RNAi-Ⅱ和RNAi-Ⅲ四种不同株系的小孢子培养进行比较,发现培养起始阶段,小孢子形态为球形,随着培养时间延长,RNAi株系的烟草小孢子胚胎发生的能力显著下降,RNAi-Ⅲ株系的烟草小孢子几乎不能胚胎发生,小孢子开始出现皱缩,证明NtDRP可以作为烟草小孢子胚胎发生的一个标记基因。